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裸鼠胃原位移植瘤及转移模型构建的参考浅谈
人阅读 发布时间：2022-02-10 13:58
胃癌是消化道最常见的肿瘤之一。侵袭范围从胃壁肌层、浆膜下甚至浆膜层，或伴有不同程度胃外组织、器官的转移。胃癌的侵袭和转移机制已成为胃癌防治研究的关键环节。
移植瘤在裸鼠皮下生长时，肿瘤脱离了原发部位的组织环境，通常被纤维膜包裹，干扰肿瘤血管的生成，阻碍了其进一步的生长和血行转移，因此皮下接种无法真实模拟肿瘤生物学行为和自然属性。以往用人胃癌组织或细胞系移植成功的报道均是采用异位皮下移植途径。移植瘤呈局限性生长,不发生肝、肺、脾等脏器转移、淋巴结转移。采用肿瘤原位移植技术可以更好的模拟肿瘤在原发部位的生长状况，能够更真实的模拟肿瘤生长的特点及转移过程。
一、模型制备过程：
BALB/c-nu雄性裸鼠，4周龄，
细胞：NCI-N87
模型构建：
1、收集体外培养的对数生长期的细胞,调节细胞数为1×107。
2、每只裸鼠取0.1mL皮下成瘤，长至直径为1cm时取出移植瘤。
3、术前禁食12h，腹腔注射40mg/kg Pelltobarbitalum Natricum 麻醉，瘤组织切成约1x1mm直径的小块，常规消毒皮肤,选择左侧正中旁切口，打开腹腔将胃拉出。
4、于胃大弯侧前壁浆膜层用手术刀划伤胃壁浆膜层，将预先切好的1x1mm直径瘤组织包埋入囊内，滴入10μl生物组织胶固定后，逐层缝合。
二、手术简要示意图：
NCI-N87细胞1-4w瘤体解剖图
三、相关脏器转移及构建方法：
1.SGC7901胃原位种植脏器转移情况：
（刘小慧，贺曼曼-现代生物医学进展- 2019）
45只裸鼠8周后脱颈处死进行尸体解剖，主要观察肝脏、脾脏、腹腔淋巴结、肠系膜、腹膜五个部位有无肉眼可分辨的明显转移瘤，结果显示RNAi-SDF-1组裸鼠腹腔淋巴结转移率[（3/15）]明显低于空白对照组[（10/15）]及阴性对照组[（9/15）]（x2=6.651，P=0.010；x2=5.000，P=0.025）。RNAi-SDF-1 组裸鼠肝脏转移率[（2/15）]明显低于空白对照组[（9/15）]及阴性对照组[（8/15）] （x2=7.033，P=0.008；x2=5.400，P=0.020）。此外也观察到肠系膜、脾脏、腹膜转移情况，但因例数较少，无法进行统计学分析。
2.MKN45-Luc细胞注入门静脉12周：
（TAKASHI MIWA Establishment of Peritoneal and Hepatic Metastasis Mouse Xenograft Models Using Gastric Cancer Cell Lines）
3.裸鼠腹膜转移： 腹腔注射MKNI-Luc、MKN45-Luc、N87、NUGC4不同细胞难度、不同观察期转移情况：
4.生物发光成像光子数变化情况：
（孙佳,李晓婷,张来运,等.扩散加权成像与光学成像评价小鼠胃癌移植瘤体内动态变化[J].中国医学影像学杂志,2019,27(6):5）
皮下移植瘤和原位移植瘤的大小、DWI-ADC值及光子计数动态变化MRI 皮下移植瘤截面积随时间不断增大，皮下移植瘤截面积-时间曲线斜率无明显变化（图1A）；原位移植瘤的面积随时间不断增大，第30天后肿瘤截面积-时间曲线出现平台（图1B）。皮下移植瘤的ADC值先逐渐下降，于第13天ADC值-时间曲线出现平台，然后反向上升（图1C）；原位移植瘤ADC值-时间曲线的变化相似，于第28天肿瘤ADC值出现平台，继而反向上升，但转折点的出现早于生物发光成像（图1D）。皮下移植瘤与原位移植瘤的光子数-时间曲线随时间增加，光子数升高后出现下降。皮下移植瘤光子数-时间曲线的转折点出现于第17天（图1E）；而原位移植瘤的转折点出现于第35天（图1F）。
5.MKN-45-luc细胞原位瘤活体成像荧光信号变化：
原位癌模型裸鼠体内荧光信号变化（A）为对照和 DDP / DDP-Gel 处理组暗箱内的麻醉小鼠的代表性荧光素酶图像。图片的下方为从治疗开始至结束的荧光素酶成像的时间（B）通过荧光素酶活性测量治疗后的肿瘤负荷。
6.NCI-N87细胞1-4W原位生长变化：HEX100
A-1W:肿瘤细胞排列呈团状或索状，在胃壁中浸润性生长。
B-2W:肿瘤细胞核大、深染，排列紧密，无空泡、坏死。
C-3W:肿瘤组织中心区域出现空泡、坏死。
D-4W:肿瘤组织中心区域出现大量空泡、坏死侵袭胃壁固有肌层及胃腔。
四、总结：
相比细胞悬液注射于胃浆膜下存在漏细胞、注射要求高、成瘤率低等因素，将皮下移植瘤组织再接种于裸鼠胃浆膜下做为常见的胃原位移植模型成功率更高，肿瘤组织块原位移植模型的移植成功率与转移发生率均高于同一肿瘤细胞系的原位种植。观察原位移植瘤的自发转移的发生率及组织学变化及细胞动力学改变等生物学特性，我们可以通过将细胞悬液直接注射到肝脏或是脾脏中来构建肝转移小鼠异种移植模型。
五、相关文献：
[1]甘润良,李一琴,胡萍玲,人胃癌裸鼠移植模型的建立极其生物学特性[J].肿瘤,1994.14(4):237
[2]Fu rukawa T. , Fu X. , Kubot a T. et al. Nude mouse metast atic models of human st omach cancer construct ed using orth otopic implant ation of histol ogically in tact tiss ue [ J]. Cancer Res,1993, 53: 1204-1208.
[3] Miwa T , Kanda M , Umeda S , et al. Establishment of Peritoneal and Hepatic Metastasis Mouse Xenograft Models Using Gastric Cancer Cell Lines[J]. In vivo (Athens, Greece), 2019, 33(6):1785-1792.
[4] Kopper L, Van Hanh T and Lapis K: Experimental model for liver metastasis formation using lewis lung tumor. J Cancer Res Clin Oncol 103(1): 31-38, 1982. PMID: 7076715
[5]Kanda M, Tanaka H, Shimizu D, Miwa T, Umeda S, Tanaka C,Kobayashi D, Hattori N, Suenaga M, Hayashi M, Iwata N,Yamada S, Fujiwara M and Kodera Y: Syt7 acts as a driver of hepatic metastasis formation of gastric cancer cells. Oncogene 37(39): 5355-5366, 2018.
移植瘤在裸鼠皮下生长时，肿瘤脱离了原发部位的组织环境，通常被纤维膜包裹，干扰肿瘤血管的生成，阻碍了其进一步的生长和血行转移，因此皮下接种无法真实模拟肿瘤生物学行为和自然属性。以往用人胃癌组织或细胞系移植成功的报道均是采用异位皮下移植途径。移植瘤呈局限性生长,不发生肝、肺、脾等脏器转移、淋巴结转移。采用肿瘤原位移植技术可以更好的模拟肿瘤在原发部位的生长状况，能够更真实的模拟肿瘤生长的特点及转移过程。
一、模型制备过程：
BALB/c-nu雄性裸鼠，4周龄，
细胞：NCI-N87
模型构建：
1、收集体外培养的对数生长期的细胞,调节细胞数为1×107。
2、每只裸鼠取0.1mL皮下成瘤，长至直径为1cm时取出移植瘤。
3、术前禁食12h，腹腔注射40mg/kg Pelltobarbitalum Natricum 麻醉，瘤组织切成约1x1mm直径的小块，常规消毒皮肤,选择左侧正中旁切口，打开腹腔将胃拉出。
4、于胃大弯侧前壁浆膜层用手术刀划伤胃壁浆膜层，将预先切好的1x1mm直径瘤组织包埋入囊内，滴入10μl生物组织胶固定后，逐层缝合。
二、手术简要示意图：
NCI-N87细胞1-4w瘤体解剖图
三、相关脏器转移及构建方法：
1.SGC7901胃原位种植脏器转移情况：
（刘小慧，贺曼曼-现代生物医学进展- 2019）
45只裸鼠8周后脱颈处死进行尸体解剖，主要观察肝脏、脾脏、腹腔淋巴结、肠系膜、腹膜五个部位有无肉眼可分辨的明显转移瘤，结果显示RNAi-SDF-1组裸鼠腹腔淋巴结转移率[（3/15）]明显低于空白对照组[（10/15）]及阴性对照组[（9/15）]（x2=6.651，P=0.010；x2=5.000，P=0.025）。RNAi-SDF-1 组裸鼠肝脏转移率[（2/15）]明显低于空白对照组[（9/15）]及阴性对照组[（8/15）] （x2=7.033，P=0.008；x2=5.400，P=0.020）。此外也观察到肠系膜、脾脏、腹膜转移情况，但因例数较少，无法进行统计学分析。
2.MKN45-Luc细胞注入门静脉12周：
（TAKASHI MIWA Establishment of Peritoneal and Hepatic Metastasis Mouse Xenograft Models Using Gastric Cancer Cell Lines）
3.裸鼠腹膜转移：
4.生物发光成像光子数变化情况：
（孙佳,李晓婷,张来运,等.扩散加权成像与光学成像评价小鼠胃癌移植瘤体内动态变化[J].中国医学影像学杂志,2019,27(6):5）
皮下移植瘤和原位移植瘤的大小、DWI-ADC值及光子计数动态变化MRI 皮下移植瘤截面积随时间不断增大，皮下移植瘤截面积-时间曲线斜率无明显变化（图1A）；原位移植瘤的面积随时间不断增大，第30天后肿瘤截面积-时间曲线出现平台（图1B）。皮下移植瘤的ADC值先逐渐下降，于第13天ADC值-时间曲线出现平台，然后反向上升（图1C）；原位移植瘤ADC值-时间曲线的变化相似，于第28天肿瘤ADC值出现平台，继而反向上升，但转折点的出现早于生物发光成像（图1D）。皮下移植瘤与原位移植瘤的光子数-时间曲线随时间增加，光子数升高后出现下降。皮下移植瘤光子数-时间曲线的转折点出现于第17天（图1E）；而原位移植瘤的转折点出现于第35天（图1F）。
5.MKN-45-luc细胞原位瘤活体成像荧光信号变化：
原位癌模型裸鼠体内荧光信号变化（A）为对照和 DDP / DDP-Gel 处理组暗箱内的麻醉小鼠的代表性荧光素酶图像。图片的下方为从治疗开始至结束的荧光素酶成像的时间（B）通过荧光素酶活性测量治疗后的肿瘤负荷。
6.NCI-N87细胞1-4W原位生长变化：HEX100
A-1W:肿瘤细胞排列呈团状或索状，在胃壁中浸润性生长。
B-2W:肿瘤细胞核大、深染，排列紧密，无空泡、坏死。
C-3W:肿瘤组织中心区域出现空泡、坏死。
D-4W:肿瘤组织中心区域出现大量空泡、坏死侵袭胃壁固有肌层及胃腔。
四、总结：
相比细胞悬液注射于胃浆膜下存在漏细胞、注射要求高、成瘤率低等因素，将皮下移植瘤组织再接种于裸鼠胃浆膜下做为常见的胃原位移植模型成功率更高，肿瘤组织块原位移植模型的移植成功率与转移发生率均高于同一肿瘤细胞系的原位种植。观察原位移植瘤的自发转移的发生率及组织学变化及细胞动力学改变等生物学特性，我们可以通过将细胞悬液直接注射到肝脏或是脾脏中来构建肝转移小鼠异种移植模型。
五、相关文献：
[1]甘润良,李一琴,胡萍玲,人胃癌裸鼠移植模型的建立极其生物学特性[J].肿瘤,1994.14(4):237
[2]Fu rukawa T. , Fu X. , Kubot a T. et al. Nude mouse metast atic models of human st omach cancer construct ed using orth otopic implant ation of histol ogically in tact tiss ue [ J]. Cancer Res,1993, 53: 1204-1208.
[3] Miwa T , Kanda M , Umeda S , et al. Establishment of Peritoneal and Hepatic Metastasis Mouse Xenograft Models Using Gastric Cancer Cell Lines[J]. In vivo (Athens, Greece), 2019, 33(6):1785-1792.
[4] Kopper L, Van Hanh T and Lapis K: Experimental model for liver metastasis formation using lewis lung tumor. J Cancer Res Clin Oncol 103(1): 31-38, 1982. PMID: 7076715
[5]Kanda M, Tanaka H, Shimizu D, Miwa T, Umeda S, Tanaka C,Kobayashi D, Hattori N, Suenaga M, Hayashi M, Iwata N,Yamada S, Fujiwara M and Kodera Y: Syt7 acts as a driver of hepatic metastasis formation of gastric cancer cells. Oncogene 37(39): 5355-5366, 2018.
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