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肝缺血再灌注模型(HIRI)构建浅谈

人阅读 发布时间:2022-03-29 16:41

简介:

1960 年, Jennings 首先提出缺血再灌注损伤的概念,即缺血器官、组织重新获得血液供应,不仅不能使组织、器官功能恢复反而加重了功能代谢障碍及结构破坏,这种现象称之为缺血再灌注损伤。

在传统的肝脏肿瘤切除、肝内胆管结石、肝破裂手术中,为防止大量出血及影响术中视野,需要暂时性选择性阻断入肝血流。但术后患者可有食纳差、乏力、皮肤巩膜黄染等临床表现、肝功能进行性下降,肝衰竭等并发症;究其原因,一定条件下恢复肝组织血氧供应后,肝组织功能代谢障碍及结构破坏进一步加剧的过程,即为肝缺血再灌注损伤(HIRI)。一直以来,HIRI 在一定程度上制约肝脏外科手术特别是肝移植手术的发展,针对 HIRI 机制及预防治疗措施的研究是肝脏外科的研究热点之一。


模型制备:
SD 大鼠,雄性,8~10 周龄。
术前准备:SD 大鼠术前禁食 12 h。
建立 70% 肝缺血再灌注模型:
1、3% 异氟烷气体麻醉,麻醉成功后,采取仰卧位,用棉线将大鼠四肢和头部固定在实验板上。
2、备皮,75% 酒精消毒,铺单。
3、取剑突至上腹部纵行正中切口 5 cm,用镊子夹起腹部皮肤,依次切开、止血,注意避免损伤剑突。
4、腹膜用湿纱布保护,使用腹腔撑开器、小拉钩充分显露肝脏及胃肠道,将肝周围韧带分离;
5、解剖肝门,钝性分离出支配肝左、中叶的肝蒂后,迅速以小号无损伤动脉夹闭。
6、肝左中叶颜色由红色逐渐转为苍白或土灰色,而肝右肝叶颜色无明显变化,说明肝血流阻断成功。
7、阻断 45 min 后移除血管夹,见肝左中叶颜色逐渐红润,说明肝脏再灌注成功。再灌注期间缝合关闭腹腔。

下图为阻断左、中叶肝蒂前、后及再灌注后肝脏颜色变化:



HIRI 24h肝脏解剖图:



HIRI 缺血 45min 再灌注 1-28D HE 染色:

Sham 组大鼠肝索排列规则呈放射状,肝细胞和肝窦内皮细胞形态正常。

HIRI 组 1-3d 凝固性坏死, 大量血窦膨胀, 红细胞渗出到肝锁, 嗜伊红细胞增多,严重坏死, 失去肝脏结构, 肝索崩解, 出血, 嗜中性粒细胞渗入。7-14d 细胞质空泡化, 病灶核固缩,窦扭曲不规则,肝细胞不同程度水肿及气球样变,可波及整个肝小叶。21-28d 逐渐趋向自愈,肝索排列轻度紊乱。


SD 大鼠 HIRI 缺血 45min 再灌注 1-28D ALTSODTNF-aMDA 指标含量变化:


缺血再灌注损伤时,氧自由基产生和清除之间的动态平衡被打破,机体清除自由基能力减弱,致使组织中脂质过氧化产物大量蓄积,从而加重炎症反应。SOD 是机体清除氧自由基的主要物质,反映生物体对抗脂质过氧化损伤的能力。MDA 是脂质过氧化反应的代谢产物,可造成细胞脂质过氧化损伤。与假手术组比较,模型组大鼠术后肝脏 SOD 活性下降,MDA 含量增高,表明缺血再灌注损伤后机体内氧自由基未能有效清除,导致细胞膜脂质过氧化,损伤肝细胞。

HIRI 相关方向研究,摘自相关文献:

1、在「AMPK 激动剂预处理对肝缺血再灌注损伤大鼠模型的影响及相关机制」中,HIRI12 h、24 h、72 h 后,实验组大鼠肝小叶结构较假手术组紊乱,肝索断裂,部分肝细胞出现水肿、空泡样变性及少许坏死导致的气球样变,中央静脉及肝血窦扩张、充血,肝索断裂,缺血再灌注后 24 h,对照组与实验组肝组织损伤较 12 h 加重,对照组见肝小叶结构紊乱进一步加重,肝细胞水肿、空泡样变性及坏死增多,中央静脉及肝血窦扩张、充血明显,汇管区可见少许炎症细胞浸润。




2、HIRI 4 h 后,表明 HIRI 发生时,肝脏产生大量 ROS,EUP 减弱了 I/R 引起的 ROS 的上升。与假手术组相比,IR 组观察到大量红色荧光,说明 HIRI 发生时肝脏产生大量 ROS,而 EUPH 组红色物质明显减少。

「Anti-Inflammatory and Antioxidant Effect of Eucommia ulmoides Polysaccharide in Hepatic Ischemia-Reperfusion Injury by Regulating ROS and the TLR-4-NF-κB Pathway」



3、肝 I/R 损伤是肝移植的一大挑战。严重的 I/R 损伤直接导致术后挑战性,并发症甚至移植失败。如何减轻肝 I/R 损伤一直是肝移植领域的研究热点。在过去的几十年里,基础和临床研究都致力于开发一种新的策略来预防肝 I/R 损伤,但仍缺乏显著有效的治疗方法。在「25-Hydroxycholesterol mitigates hepatic ischemia reperfusion injury via mediating mitophagy」一篇中,相关研究表明 25 HC 预处理可减轻肝 I/R 损伤,有望成为一种新的临床干预手段。



4、在「Ischemia/Reperfusion Accelerates the Outgrowth of Hepatic Micrometastases in a Highly Standardized Murine Model」一篇中,构建结肠癌肝转移的肝缺血再灌注损伤模型,通过 caspase-3 的免疫组化发现:在对照组中肝叶中很少观察到凋亡的肝细胞。然而,在 I/R 的肝叶中,坏死组织区域周围的肝细胞中检测到高表达 caspase-3 染色。这些细胞被发现与浸润淋巴细胞的存在密切相关。



结肠癌肝转移瘤后I/R对肿瘤的生长速率影响:


总结:
​采取阻断 70% 大鼠肝脏血流缺血 45 分钟以上建立的肝缺血再灌注模型,结合肝脏组织学以及 Suzuki's 评分来看,在缺血再灌注不同时间后均出现了不同程度的炎性细胞聚集,肝细胞的坏死。模型组在 7d 后,ALT、SOD、TNF-a、MDA 等指标逐渐恢复自愈。

为提高术后成活率,造模中应注意:
1. 大鼠术前应禁食不禁水 12 h,避免术中胃肠道的干扰;
2. 腹中切口尽量小,避免不必要的损伤;
3. 分离肝蒂时要非常小心,钝性分离,否则易引起大出血,休克死亡;
4. 尽量少干扰其他组织,尤其注意不可损伤肝蒂下方的下腔静脉;
5. 夹闭时要一次完成,否则容易出现缺血预适应,影响模型;
6. 缺血期应注意保持腹腔充分水化,用湿纱布覆盖暴露部位;
7. 术中、术后都应将大鼠放置在保温毯上充分保暖;
8. 关腹前腹腔内补液 1 ml,利于术后恢复。

相关文献:
1.Bilt J V D , Velde E T , Nijkamp M W , et al. Ischemia/reperfusion accelerates the outgrowth of hepatic micrometastases in a highly standardized murine model[J]. European Journal of Gastroenterology & Hepatology, 2006, 18(1):A3.
2.Lim C ,  Broqueres-You D ,  Brouland J P , et al. Hepatic ischemia-reperfusion increases circulating bone marrow-derived progenitor cells and tumor growth in a mouse model of colorectal liver metastases[J]. Journal of Surgical Research, 2013, 184(2):888-897.
3. 卿雍成. 依达拉奉对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究 [D]. 南华大学.
4. Sherif I O , Al-Shaalan N H . Alleviation of remote lung injury following liver ischemia/reperfusion: Possible protective role of vildagliptin[J]. International Immunopharmacology, 2021, 91:107305.
5.Cao Q ,  Luo J ,  Xiong Y , et al. 25-Hydroxycholesterol mitigates hepatic ischemia reperfusion injury via mediating mitophagy[J]. International Immunopharmacology, 2021, 96(2):107643.
6.Peralta C , MB Jiménez-Castro, Gracia-Sancho J . Hepatic ischemia and reperfusion injury: Effects on the liver sinusoidal milieu[J]. Journal of Hepatology, 2013, 59( 5):1094-1106.
7.Gao W , Feng Z , Zhang S , et al. Anti-Inflammatory and Antioxidant Effect of Eucommia ulmoides Polysaccharide in Hepatic Ischemia-Reperfusion Injury by Regulating ROS and the TLR-4-NF- κ B Pathway[J]. BioMed Research International, 2020, 2020:1-11.

 

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