肠道微生物专题前沿文献解读 

 

 

 

2023年4月12日，南方医科大学李娟、周宏伟及陈世贤共同通讯在Cell Host & Microbe（IF=31.31）在线发表题为“Fusobacterium nucleatum aggravates rheumatoid arthritis through FadA-containing outer membrane vesicles”的研究论文，该研究表明具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）通过含FadA的外膜囊泡加重类风湿性关节炎。

 

背景介绍

 

类风湿性关节炎 (RA) 是一种自身免疫性疾病，影响着世界上近 1% 的人口。1它的特点是高水平的血清炎症细胞因子，包括 IL-6 和 TNF-α，它们会触发关节的炎症过程，导致进行性关节破坏和身体残疾。

肠道微生物群越来越受到关注，因为它在维持宿主生理健康方面发挥着重要但复杂的作用。通过对 RA 患者的粪便、血清和关节滑液样本的多组学分析表明，肠道微生物群通过代谢物分泌和微生物入侵与 RA 的严重程度密切相关。最近发现肠道微生物普雷沃氏菌在 RA 患者中大量存在，并通过促进有机酸的产生而加剧关节炎。这些发现表明肠道微生物群在 RA 中起着重要作用。肠道微生物群很难通过细胞间转移到远处器官，主要通过分泌代谢物、蛋白质和外膜囊泡(OMV) 转移。因此肠道微生物群相关的 OMV 在调节肠道微生物群对 RA 发展的贡献中发挥作用的具体机制仍是未知的。

 

主要发现

 

①肠道中核梭杆菌( F. nucleatum ) 在 RA 患者中富集并且与炎症细胞因子呈正相关。

②具核梭菌加重CIA小鼠的关节炎。

③具核梭菌通过将含有蛋白质FadA的OMV递送到关节中以通过靶向 Rab5a-YB-1 轴触发局部炎症。

 

研究结果

 

01 具核梭杆菌(F. nucleatum)在 RA 患者中富集并与血清炎性细胞因子呈正相关

研究者收集了 RA 患者（n = 49）和健康对照（HC）（n = 25）的血清和粪便样本。通过16s测序，研究者比较了RA 患者和HC 患者的粪便微生物群组成。发现与HC组相比，RA患者中有几种微生物群落丰度显著不同。特别是，瘤胃球菌属、梭杆菌属、丹毒梭菌属和线粒体属在 RA 患者中比在HCs中明显更丰富。而梭杆菌属的丰度与RA病人的疾病指标（如DAS28-ESR, RF, anti CCP, CRP, ESR）呈正相关。

以上表明梭杆菌属与RA症状之前存在某种关系。为了进一步确定哪种梭杆菌菌株与 RA 相关，我们通过实时 PCR 检测了RA患者中两种广泛研究的梭杆菌菌株具核梭杆菌(F. nucleatum)和致命梭杆菌( F. mortiferum ) 。结果发现，具核梭杆菌(F. nucleatum)与RA的疾病指标呈正相关。

 

02 具核梭杆菌加重 CIA 小鼠的关节炎

研究者为了探究具核梭菌在RA中的潜在致病作用，通过用具核梭杆菌、大肠杆菌（阴性对照）治疗胶原诱导性关节炎 (CIA) 小鼠来评估具核梭杆菌对关节炎的影响。研究者发现与对照组相比具核梭菌处理使CIA小鼠骨侵蚀加重，局势细胞和中性粒细胞增加，以上表示具核梭菌能够促进CIA小鼠的滑膜炎症。为了进一步探究具核梭菌在介导关节炎中的因果作用，研究者使用了梭杆菌属的窄谱抗生素——甲硝唑，来特异性消除CIA 小鼠的具核梭菌。

结果显示，使用了甲硝唑的使用消除了CIA小鼠的具核梭菌，并显著改善了关节炎水平，以及嗜中性粒细胞和巨噬细胞在关节中的浸润。这暗示具核梭杆菌在介导关节炎恶化中发挥关键作用。

 

 

03 具核梭杆菌通过分泌OMV加重关节炎

为了了解具核梭杆菌影响关节炎的具体作用途径。OMV 分泌是革兰氏阴性菌与宿主相互作用的最关键途径之一。研究具核梭菌对关节炎的影响是否取决于OMV，研究者使用GW4869预处理具核梭杆菌以削弱 OMV 的释放。结果显示，GW4869 处理并未降低具核梭杆菌的丰度但显着降低了具核梭菌分泌的 OMV并完全阻止了具核梭杆菌的对关节炎的促进作用。这表明 OMV 在具核梭杆菌引发的关节炎中发挥了关键作用。

研究者使用荧光染料去标记F.n OMV（具核梭杆菌OMV）并通过活体荧光示踪，发现F.n omv在6小时后遍布全身，并在12小时后最终在四肢积累，这证明F.n OMV是可以运输到关节处的。然后使用F.n OMV（对照使用空载体和大肠杆菌OMV）处理CIA小鼠，结果表明F.n OMV可以显著促进RA炎症反应。

 

 

04 FadA介导F.n OMVs对关节炎的加重作用

研究者为了探究F.n OMV是如何影响CIA小鼠的，并探究其作用的靶点。研究者分别用DNA酶、RNA酶和蛋白酶分别预处理F.n OMV，并与巨噬细胞共培养发现蛋白酶预处理的F.n OMV减少了巨噬细胞的炎症反应。此外还使用多粘菌素B去中和LPS的反应，发现并不影响F.n OMV的促炎效果。这暗示F.n OMV促进关节炎依赖于蛋白质。具以往研究发现FadA和Fap2是具核梭杆菌的关键蛋白，研究者通过F.n OM的蛋白质组学分析确定F.n OMV中存在FadA而不是 Fap2，同时通过免疫荧光也观察到FadA在关节处的巨噬细胞内富集。

为了确定 FadA 对关节炎的作用，研究者构建了一个敲除了FadA的具核梭杆菌菌株。并收集到了其不含FadA的OMV（ΔFadA−/− OMV）。结果发现尽管ΔFadA−/− OMV可以被巨噬细胞吸收但它们不再刺激炎症。同时研究者构建了FadA重组蛋白，然后通过静脉注射到CIA小鼠体内。结果发现FadA重组蛋白并没有加剧关节炎，所以这表明OMV对将FadA递送至关节以发挥其对局部关节炎的作用至关重要。

 

05 Rab5a介导含FadA的F.n OMVs对关节炎的加重作用

研究者为了阐明Fn OMV 促进的 RA的下游分子机制，对F.n OMV 或Fn ΔFadA−/− OMV处理的巨噬细胞进行了转录组学分析。发现了FadA的下游靶标Rab5a。通过沉默巨噬细胞的Rab5a能够抑制F.n OMV的促炎作用，同时研究者还发现Rab5a在F.n OMV处理的CIA小鼠的关节滑液高表达。此外，甲硝唑给药可消除降低具核梭杆菌处理的CIA小鼠中的 Rab5a 表达。这些数据都表明 Rab5a可能是包含 FadA 的F.n OMV的目标。为了证明这一点，研究者构建了Rab5a敲除小鼠。结果发现F.n OMV处理不能促进Rab5a敲除小鼠的关节炎症，证实了Rab5aF.n OMV的关键下游靶标。

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06 F.n OMV通过FadA-Rab5a-YB-1轴刺激炎症

考虑到 Rab5a 的促炎作用，研究者通过下拉靶向 Rab5a 的蛋白质并进行蛋白质组学分析来筛选其加重炎症的潜在信号。这些蛋白主要与转录活性调控有关，其中转录因子YB-1丰度最高。Co-IP结果显示F.n OMV处理促进了YB-1和Rab5a之间的结合。此外，F.n OMV促进了YB-1的磷酸化和核易位，而Rab5a缺失则降低了YB-1的磷酸化和核易位。而沉默巨噬细胞中的YB-1表达部分逆转了F.n OMV促炎的作用。双荧光素酶试验发现转录因子YB-1可以促进炎症因子IL-6和TNF-α的转录。综上所述，F.n OMV通过FadA-Rab5a-YB-1轴促进关节炎症进程。

 

 

总结

 

具核梭杆菌可通过分泌并向关节输送含毒力因子FadA的外膜囊泡，活化滑膜巨噬细胞的Rab5a-YB-1轴，从而促进关节炎症。这些发现为具核梭杆菌促进RA提供了重要的因果性和机制性证据，也为改善RA提供了新的潜在治疗靶点。

 

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YB1 Rabbit mAb	RMAB50640
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