Western Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如PVDF膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

 

Western Blot

实/验/准/备

 

Bioswamp Life Science Lab

01 蛋白提取

 

需准备：RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂

02 蛋白定量

 

需准备：BCA蛋白定量试剂盒

03 电泳

 

需准备：凝胶试剂盒、上样缓冲液、电泳缓冲液、Marker、电泳仪

04 转膜

 

需准备：NC膜/PVDF膜、转膜液、滤纸、转膜仪

05 封闭

 

需准备：快速封闭液

06 孵育一抗

 

需准备：一抗、抗体稀释液、抗体孵育盒

07 孵育二抗

 

需准备：二抗、抗体稀释液、抗体孵育盒

08 曝光

 

需准备：ECL显影液、化学发光分析仪

 

 

Western Blot

操/作/流/程

 

Bioswamp Life Science Lab

I．蛋白提取

组织样本处理：

将组织剪成细小的碎片，按每 20mg 组织加入 150-250μL 裂解液的比例加入裂解液（裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂），匀浆器匀浆直至完全裂解。

裂解后的样品4℃ 12000g 离心15分钟，取上清，进行蛋白质定量后贮存于-80℃冰箱。

 

细胞样本处理：

用细胞刮将细胞从培养皿中刮下，收集到EP管中，根据细胞数量加入适量的裂解液（裂解液中加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），匀浆器匀浆直至完全裂解。裂解后的样品4℃ 12000g 离心15分钟，取上清，进行蛋白质定量后贮存于-80℃冰箱。

 

II．蛋白定量

1)标准曲线的绘制：取一块酶标板，按照下表加入试剂

 

2) 根据样品数量，将 BCA 试剂 A 与试剂 B 按体积比为 50:1 配制适量 BCA 工作液，充分混匀；

3) 各孔加入 160μL BCA 工作液；

4) 把酶标板放在振荡器上振荡 30sec，37℃放置 30分钟，然后在 562nm 下测定吸光度。以吸光值为横坐标，蛋白浓度（μg/μL）为纵坐标，绘出标准曲线；

5) 在酶标板中加入 2μL 待测蛋白和18μL PBS（稀释 10 倍），加入 160μL BCA工作液，把酶标板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30分钟，然后在562nm下测定吸光度；

6) 根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应的蛋白浓度（μg/μL），乘以样品稀释倍数（10）即为样品实际浓度（单位：μg/μL）。

 

III．制胶 

制胶：先配分离胶，再配浓缩胶。

1) 下层分离胶的制备

根据目的蛋白的分子量选择不同的凝胶浓度，高分子量蛋白用低浓度胶，低分子量蛋白用高浓度胶分离。

不同浓度的分离胶按下表进行配制，待下层胶凝固后进行上层浓缩胶的配制。

2) 上层浓缩胶的制备

根据需要按下表配制浓缩胶，并插好梳子。

 

3) 步骤说明：

• 玻璃板对齐后然后垂直卡在制胶架中卡紧，准备配胶。

• 按前面方法配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，用枪吸取1ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带下缘以下5mm高度时即可，给浓缩胶留出足够空间（梳齿长再加1cm）。然后胶上加一层去离子水，液封后的胶凝的更快。

• 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝固（30mins）。再等3mins使胶充分凝固就可倒去胶上的水，并用滤纸将水吸干。

• 按前面的方法配5％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平（梳子使用前保证干净且干燥）。待到浓缩胶凝固后（室温30mins），将凝胶放入电泳槽中，小玻璃板面朝内。

 

IV．上样及电泳

1) 上样

每孔上样量为20μg蛋白，一般每孔10-15μl。一般marker加3-5μl，可以根据实验要求调整上样量。根据蛋白定量结果取所需蛋白加入适量上样缓冲液，沸水浴 10min 使蛋白变性后离心取上清上样。

将配制好的 PAGE 胶放入电泳槽中，加入适量电泳缓冲液，取下梳子用枪轻轻吹打加样孔，避免孔内有余胶残留影响上样。将准备好的样品用加样枪慢慢加到对应的孔内。

 

2) 电泳

将电泳槽与电泳仪相接，红接红，黑接黑。

一般浓缩胶80V 30min，分离胶120V 45min，根据具体实验要求调整电压和时间。当染料到达胶底部时即可终止电泳，进行下一步转膜。（小分子蛋白实验时染料到达胶一半即可）

 

V．转膜

转膜分为湿转和半干转，这里介绍湿转方法。

湿转转膜中，三明治的排列为：滤纸/胶/膜/滤纸（膜在右上角剪个口子来确定正反，滤纸三层，胶，膜，滤纸三层），用电转缓冲液浸湿后，置于转膜用的夹子中，将夹子的黑面对槽的黑面，夹子的白面对槽的红面，胶于负极而膜置于正极。电转移时会产热，在槽的一边放冰块来降温。恒流300mA转膜90min即可。

转膜前将PVDF膜在甲醇中浸泡5min，用于活化；再孵育于冰冷的电转缓冲液中2 min。

• 转膜过程要控制温度，转完之后里面的冰块不可以融化。

• 转膜电流/电压和时间由目的蛋白分子量决定。

 

VI． 膜的封闭及抗体孵育

1) 封闭：

5%脱脂奶粉室温封闭 2h 或 4℃过夜。

封闭完成后TBST或者PBST洗涤3次，每次5分钟。

2) 一抗：

根据说明书稀释抗体，抗体加入封闭液中稀释到所需浓度，和膜室温孵育 1h 或 4 ℃孵育过夜。

3) 二抗：

孵育一抗的膜用TBST或PBST 洗涤3次，每次5min。随后根据用量，按照1:10000 稀释 HRP 标记的二抗8ml，与膜室温孵育 1h 或 4 ℃孵育过夜。用TBST或PBST洗涤4次，每次5min。(二抗稀释倍数视情况而定)

 

 

VII．显色

ECL 化学发光检测：

ECL( Enhanced Chemiluminescence) ：原理是鲁米诺被HRP和H2O2氧化，产生荧光，这个过程被发光增强剂加强，具有稳定性好，灵敏度高、背景低等特点。

将膜放置在暗室中，根据用量取 ECL 发光液 A 和 B 等量混匀，加在膜的正面与之充分接触。然后将膜置于全自动化学发光分析仪中检测，通过 TANON GIS 软件读取相关条带灰度值。

注意事项：

• 建议使用高信号、高灵敏度，高稳定性的化学发光试剂；

• 显影液覆盖整个印迹膜；

• 将显色液从冰箱拿出，注意避光，将A液，B液按照等体积混合，一般一张膜用量1ml，用枪均匀滴在膜表面，剪开一个自封袋，用镊子把膜平整放在自封袋中，压好，避免产生气泡，放在光片夹中。

 

 

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