2023年5月，武汉大学口腔医学院口腔生物医学教育部重点实验室张玉峰课题组的原创性研究论文在高水平期刊《International Journal of Oral Science》（IF:24.9，中科院一区）上在线发表，题为“CD301b+ macrophage: the new booster for activating bone regeneration in periodontitis treatment (CD301b阳性巨噬细胞：牙周炎治疗中激活骨再生的新推手)”。本文以小鼠为实验模型，首次报道了CD301b+巨噬细胞在牙周骨修复当中的作用。

 

牙周炎是一类导致牙周骨损伤甚至于牙齿脱落的慢性炎症，故而挽救并修复受损牙齿是治疗中的重大挑战。研究者致力于调节免疫细胞以减轻组织微环境中的炎症水平，从而抑制破骨细胞生成并促进牙周骨修复。然而，来自于临床患者的单细胞测序结果表明此类牙周治疗方案也存在相关的问题，包括成骨细胞谱系损伤以及骨再生活力不足。

巨噬细胞在抵御细菌侵染、调节免疫反应，以及介导发炎组织的损伤与修复方面发挥着重要作用。传统上基于其免疫调节能力，将巨噬细胞分为促进炎症的经典激活巨噬细胞（M1）和减轻炎症的非经典激活巨噬细胞（M2）。巨噬细胞异质性很高，有研究表明CD301b+不同于一般M2巨噬细胞，具有很强的促进再生能力。

运用外层包被有免疫细胞膜成分的仿生纳米材料，可减轻炎症并创造有利于组织再生的微环境，例如巨噬细胞包被的纳米材料已经被用于消炎和促进骨损伤的修复过程。不过，牙周炎的免疫调节治疗策略目前仍局限于富集抗炎性免疫细胞，如M2巨噬细胞和调节性T细胞。

 

 

研究人员通过形态学、免疫荧光、qPCR和免疫组化等实验方法，验证了小鼠牙周炎丝线结扎模型对牙造成的损伤和去除结扎后一定程度的恢复。

图1. 小鼠牙周炎骨再生模型

 

通过流式细胞分析，牙周组织中的巨噬细胞主要可分为3类：M2抗炎性巨噬细胞、促炎性巨噬细胞、CD301b阳性巨噬细胞。如Fig.2所示，CD301b阳性巨噬细胞在恢复期占比更高，而炎症期相对数量较少。CD301b+巨噬细胞与M2巨噬细胞（CD206+）的相对丰度有较强的相关性，这两个群体有部分重合但不完全一致。免疫荧光结果显示，相比于CD206+巨噬细胞，CD301b+巨噬细胞更倾向于聚集在骨修复的前沿。

图2. CD301b阳性巨噬细胞特征

 

微型CT和苏木.精伊红染色结果表明，当小鼠CD301b+巨噬细胞被白喉毒素去除掉后，牙骨生成明显受到削弱，其他骨相关参数的测量结果也显示出相同的趋势。免疫荧光结果表明，在白喉毒素处理的小鼠牙周组织中，成骨细胞相关的标志物碱性磷酸酶（ALP）和Osterix（OSX）明显减少。

图3. 牙周骨修复需要CD301b+巨噬细胞

 

研究人员对CD301b阳性和阴性巨噬细胞群体分别进行了转录组分析，通过GO分析发现有78个与骨生成相关的基因在CD301b+巨噬细胞中显著上调，其中包括igf1。利用白介素4，研究者从原代巨噬细胞（BMDM）诱导出了约40%的CD301b+巨噬细胞，而在添加有白介素1β和肿瘤坏死因子α的环境中，诱导出CD301b+巨噬细胞仅有不足10%。ALP和茜素染色结果表明，CD301b+巨噬细胞能促进骨髓间充质干细胞（BMSC）分化为成骨细胞，而该能力可被IGF-1中和抗体所阻遏。免疫印迹结果显示来源于CD301b+巨噬细胞的IGF-1能够刺激骨髓间充质干细胞中IGFR、Akt和mTOR的磷酸化。

图4. 来源于CD301b+巨噬细胞的IGF-1促进成骨细胞分化

 

利用小鼠中性粒细胞膜作为外壳，与载有白介素4的“金纳米笼”（AuNCs）核心，组成可诱导成骨的纳米胶囊（OINCs）。透射电镜下可观察到方形的核心外包裹着一层厚度约5nm的膜。动态光散射测量结果表明OINCs的水合粒径比AuNCs约大15nm，同时zeta电位减小。两者的紫外-可见光吸收峰都在690nm附近。研究人员分别在体外和体内测试了纳米工具的光热效应和药物释放效果。免疫印迹结果验证了OINCs中含有肿瘤坏死因子α受体和白介素1β受体。最后，研究人员又采用贝茵莱生物的ELISA试剂盒，验证了其所开发的OINCs具有吸收肿瘤坏死因子α和白介素1β的能力。

图5. 可诱导成骨纳米胶囊的设计与特性

 

研究人员向实验组小鼠的牙周损伤处注射OINCs，而对照组给予AuNCs或生理盐水。实验结果表明，注射有OINCs的小鼠牙周组织中CD301b+巨噬细胞显著增多，ALP显著上调，免疫细胞浸润减少，骨高和骨重也显著增加。

图6. OINCs提升牙周骨再生能力

 

该团队在小鼠模型中发现牙周组织中聚集的CD301b+巨噬细胞亚群能够通过IGF-1/Akt/mTOR信号通路促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，从而推动牙周骨再生。该团队还设计了可诱导成骨的纳米胶囊，能够通过减轻牙周炎症并诱导巨噬细胞分化来增强牙周的成骨活性，具有治疗应用前景。

 

 

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Mouse Interleukin 1β (IL-1β) ELISA Kit	MU30369	73

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