PBMC样本

 

 

方法1：直接对新鲜PBMC进行冻存

■ 收获PBMC细胞，纯血清重悬PBMC。细胞浓度相比新鲜样本最好高一点,最好是2×10⁷；

■ 逐滴加入等体积20%的DMSO(需预先配制，4℃预冷)，混匀;

■ 将冻存管放于塑料泡沫盒中，外面用保鲜袋扎紧，放于-80℃冰箱中，过夜。继而转移至液氮中冻存即可。

进行后续实验和染色时，需进行如下复苏步骤：

■ 取出冻存管，37℃水浴复苏细胞；

■ 用移液管将将冻存管中的细胞转移至15 mL离心管中；

■ 逐滴加入5倍于冻存液体积的培养液（预先平衡好），边加边混匀，这一步主要是为防止PBMC的渗透压变化太大，导致细胞破裂或损伤；

■ 再加入5倍体积的培养液，混匀，离心；

■ 重悬细胞后，再加入10ml培养基洗涤一次；

■ 关键步骤：将细胞放置于37度培养箱中 室温平衡0.5-1h，再进行后续的染色实验（这一步很重要，刚复苏的细胞上的一些MHC表型会存在显著差异，但是只要37度复温0.5h后，表型就会显著恢复正常。）

 

 

   

 

方法2：新鲜的PBMC进行预处理后冻存

例如，对细胞进行固定或已经进行表面抗体的染色时，刺激阻断等处理时

I 细胞固定与保存

■ 100μL4%多聚甲醛（或1ml/10⁷细胞）重悬细胞，4°C孵育10-20分钟；

■ Staining Buffer清洗细胞2次；

■ 最后用90%FCS+10%DMSO重悬细胞-80°C 长期保存。

 

II 对已固定的细胞进行破膜

■ 对于冻存细胞，清洗2次去除DMSO；

■ 将细胞重悬于PBS，如果要进行胞膜内染色，则重悬于Perm/Wash buffer，孵育15分钟；

■ 离心去上清；

■ 进行后续的流式染色步骤即可。

 

  

不论是使用方法1还是方法2，都可以使我们长期保存流式细胞样本，方便我们对样本进行批处理检测。

需要注意的是某些免疫表型细胞在冻存之后绝对计数会有减少，但是与新鲜血液之间具有良好的相关性（除了噬碱性粒细胞），另外相比于新鲜样本部分细胞因子冻存后检测受到影响。

 

组织样本

 

 

不同于血液/骨髓中的细胞,组织样本处理稍微复杂：

 

组织中的细胞与细胞之间有各类胶原蛋白易粘连在一起,需要经过酶解消化

 

组织样本中免疫细胞占比很少，有大量组织细胞干扰，且部分组织细胞自带荧光

 

组织样本放置时间长后组织会出现自溶现象，影响检测结果

所以为了确保组织样本的流式实验的顺利完成，我们要做好样本的前期处理，从样本收集开始就要注意。

 

■ 取材：取材后应低温保存，一般浸泡于PBS或1640等基础培养基中；

■ 处理：把组织样本制备成单细胞悬液，主要通过机械法和酶消化法或两种方法结合处理；

■ 机械剪碎：2-4mm碎块；

■ 酶消化：是关键的步骤，主要目的是为了破坏组织间的胶原，水解细胞间紧密链接的蛋白，水解粘多糖。

 

   

 

这里给大家一个常做的脾脏机械法处理的步骤作为参考：

■ 将脾脏组织转移到35mm无菌培养皿中。后续如需进行细胞分选，在培养皿中加入5mL 1640基础培养基。如解离组织后不需细胞分选，可在培养皿中加入含1mM EDTA的PBS；

■ 从5ml无菌注射器中取出活塞/柱塞。使用扁平的末端部分以温和画圆的方式研磨脾脏，碾磨至无明显红色结团为止，这样可以破坏脾脏和髓质，释放脾细胞；

■ 将一个70μm细胞过滤器置于15或50mL无菌锥形管上，并用2mL推荐培养基润洗滤网。注意：细胞可能会黏附于干燥的滤网上，润洗滤网可以减少这种情况；

■ 使用润洗过的5或10mL移液管或移液枪将脾细胞吹打均匀；

■ 将培养皿中的物质全部转移至润洗过的70μm细胞过滤器中。使用注射器的活塞/柱塞。使细胞和组织通过滤网。用3mL培养基冲洗滤网；

■ 将收集到离心管里的脾脏细胞平衡后放置于离心机离心，转速为250g-300g，离心时间5min；

■ 取出离心管，倒去上清，轻轻敲击试管重悬细胞。

 

细胞数量

 

 

 

流式检测的细胞数量至少要满足10⁵，如果我们制备的样本细胞低于这个数量就无法满足下游流式检测实验后细胞的得率，这样对于实验者来说这个样本制备就毫无意义。

相反对于血液/骨髓/脾脏这类样本，细胞数有时往往会太多。一个脾脏内至少就有10⁸的细胞数，如果不对细胞进行计数而直接取了单细胞悬液就去染色，将导致抗体染色效率直线下降。所以针对这类样本，细胞计数是一定要去做，推荐每个样本的细胞数在10⁶左右为佳。

 

 

细胞活性

 

 

需要注意的细胞样本处理时,特别组织是出现死细胞和处理中的破损细胞,将会对实验结果产生较大的影响，所以我们需要保证在样本处理后,想要得到较好的分析结果,则需要加入细胞死活染料来进行死细胞的排除。

如下图使用可固定型细胞死活鉴定染色液(DYE00001)结果，区分细胞死活很明显的优化了实验结果。

左图：只研究活细胞，阳性细胞比例为61%

右图：没有区分细胞死活，阳性细胞比例为40%

 

   

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