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IF=17.1 | 肺纤维化可以治愈吗?

人阅读 发布时间:2024-05-31 08:44

文献总览

IF:17.1

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研究背景

肺纤维化(PF)是一种慢性、进行性和侵袭性间质性肺疾病,其特征是不可逆的肺泡结构破坏和间质性瘢痕形成,可损害肺功能并导致死亡虽然抗纤维化药物如吡非尼酮和尼达尼布可以靶向成纤维细胞并抑制胶原合成,但它们不能逆转已有的纤维化、促进肺修复或降低死亡率。因此,迫切需要有效的治疗方法。

研究发现,2型肺泡上皮细胞(AEC2)衰老是肺纤维化(PF)发病的关键。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)消耗酶簇分化38(CD38)作为衰老细胞的标志物,在PF患者的AEC2s中高表达,因此被认为是潜在的治疗靶点。脐带间充质干细胞(MSC)衍生的细胞外囊泡(MSC-evs)作为一种无细胞治疗方法在抗衰老和抗纤维化治疗方面具有广阔的临床应用前景。本研究通过使用装载有CD38抗原受体-CD8跨膜片段融合质粒的慢病毒转染间充质干细胞,构建了CD38抗原受体膜修饰的间充质干细胞-EVs(CD38-ARM-MSC-EVs),以靶向AEC2s并缓解PF。与MSC-EVs相比,本研究中设计的CD38-ARM-MSC-EVs在体外和腹腔给药后的自然衰老小鼠模型中表现出更高的CD38抗原受体和抗纤维化miRNAs表达量,并靶向高表达CD38的AEC2s衰老细胞。CD38-ARM-MSC-EVs能有效恢复NAD+水平,逆转上皮-间充质转化表型,使体外衰老的A549细胞恢复活力,从而减轻多种年龄相关表型,缓解衰老小鼠的PF。因此,这项研究提供了一种设计MSC-EVs的技术,并支持我们将CD38-ARM-MSC-EVs开发成具有高度临床潜力的抗PF药物。

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研究结果

 

01

CD38-ARMMSC-EVs的构建与表征

首先,作者通过修饰CD38抗原受体膜来改造间充质干细胞,从这些间充质干细胞中分离出表达CD38抗原受体的EV,以CD38阳性的AECs为靶标(图1A),构建了CD8跨膜区、CD38抗原受体和CD38抗原受体-CD8跨膜区的质粒,并将其包装到慢病毒中,然后将慢病毒转染给间充质干细胞。接着,对从CD38-ARM-MSCs提取的EVs(CD38ARM-MSC-EVs)进行了鉴定。通过超速离心法,从工程和非工程间充质干细胞的上清液中分离出了EVs。通过激光共聚焦显微镜(图1B)和Western印迹(图1C和1D)确认了CD38-ARM-MSCEVs中的GFP表达。与MSC-EVs相比,CD38-ARM-MSC-EVs表面有效表达了anti-CD38-scFv(图1E),表明成功构建了表面高表达anti-CD38-scFv的CD38-ARM-MSC-EVs,其形态、大小、常见EV标记(CD9、CD63、CD81和TSG101)和MSC表面标记(CD73、CD90和CD105)与未修饰的MSC-EVs相似(见图1F-I)。

鉴于miRNA在EVs中的关键作用,我们进一步对CD38-ARM-MSC-EVs和MSC-EVs进行了小RNA深度测序,重点研究并比较了10种最丰富的miRNA(图1J和1K)。根据miRNA微阵列分析(GSE32358数据集),10个miRNA中有5个参与了抗PF(图1L),其中let-7i-5p和let-7f-5p在CD38-ARM-MSC-EVs中显著上调,但在PF肺样本中下调。这些发现表明,CD38-ARM-MSC-EVs的成功构建具有潜在的抗纤维化作用。

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图1  CD38-ARMMSC-EVs的构建与表征

02

CD38-ARMMSC-EVs靶向CD38high细胞

为了检测CD38-ARM-MSC-EVs是否能选择性地靶向CD38high细胞,将RAW264.7细胞(一种巨噬细胞系,M0)和人骨髓间充质干细胞(BMSCs)培养成CD38dim细胞,并将脂多糖(LPS)刺激的RAW264细胞(M1)和RPMI82细胞(一种骨髓瘤细胞系)培养成CD38high细胞,同时使用未修饰的MSC-EVs和CD38ARM-MSC-EVs进行检测。DAPI标记的M1细胞对PKH26标记的CD38-ARM-MSC-EVs的摄取量明显高于对PKH26标记的未修饰MSC-EVs的摄取量,而M0细胞对两种EVs的摄取量则没有差异(图2A-C)。同样,CFSE标记的RPMI8226细胞吸收的PKH26标记的CD38-ARM-MSC-EV明显多于PKH26标记的未修饰MSC-EV,而DAPI标记的BMSCs的吸收没有明显差异(图2D-F)。为了研究CD38-ARM-MSC-EVs靶向CD38high细胞的情况,将BMSCs和CFSE标记的RPMI8226细胞共培养,然后用PKH26标记的CD38-ARM-MSC-EVs或未修饰的MSC-EVs培养12小时。因此,RMPMI8226细胞对CD38-ARM-MSC-EVs的吸收仍然明显高于未修饰的MSC-EVs,而两种类型的EVs对BMSC的吸收没有差异,尽管BMSC对这些EVs的基本吸收明显高于RPMI8226细胞(图2D-F)。这些数据表明,CD38-ARM-MSC-EVs可以靶向CD38high的细胞。

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图2 CD38-ARM-MSC-EVs靶向CD38high细胞

03

CD38-ARM-MSC-EVs靶向衰老A549细胞并使其恢复活力

本研究选择了A549细胞(一种AEC2细胞系)来检验CD38-ARM-MSC-EVs能否靶向衰老的AECs,使用0.25μM的多柔比星(DOX)诱导A549细胞衰老,作为AECs衰老的体外细胞模型,衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-GAL)和衰老相关分泌表型(SASP)作为衰老标志物。

实验使用非诱导型A549细胞(CD38dim细胞)和0.25μMDOX诱导型A549细胞(CD38high细胞)来确定CD38-ARM-MSC-EVs靶向衰老AECs的能力(图3A)。与CD38highM1和RPMI8226细胞相似,CD38highA549细胞吸收的PKH26标记的CD38-ARM-MSC-EVs也明显多于CD38dimA549细胞,而用未修饰的MSC-EVs培养时两者之间没有差异(图3B、3C)。为了研究CD38-ARM-MSC-EVs是否与CD38highA549细胞表面CD38抗原结合,用达雷妥尤(daratumumab,一种CD38单克隆抗体)预处理细胞以阻断细胞表面CD38,然后与CD38ARM-MSC-EVs或MSC-EVs培养。值得注意的是,经过达雷妥尤单抗(daratumumab)阻断后,与CD38-ARM-MSC-EVs孵育后的PKH26阳性CD38high细胞比例明显减少(35.03% vs 22.93%,p=0.0001),而未修饰的MSC-EVs的吸收效率没有变化(26.85%vs25.19%,p=0.9976;图3B、3C)。CD38免疫荧光染色显示,CD38high细胞对CD38-ARM-MSC-EVs的摄取高于CD38dim细胞,但对MSC-EVs的摄取没有差异(图3D、3E)。这些发现表明DOX诱导的衰老A549细胞表面高度表达CD38抗原,CD38-ARM-MSC-EVs可在体外靶向这些CD38high的细胞。

接下来,为探索CD38-ARM-MSC-EVs处理是否可以使衰老的CD38highA549细胞恢复活力,并协同增强NMN对这些衰老细胞的抗衰老作用。使用CD38-ARM-MSC-EVs(ARMEVs)、未修饰的MSC-EVs(EVs)、NMN和CD38-ARM-MSC-EVs(NMN+ARM-EVs)、NMN和未修饰的MSCEVs(NMN+EVs)以及磷酸盐缓冲液(PBS;对照组)连续处理DOX诱导的衰老A549细胞2天,进行SA-β-Gal染色和ELISA检测SASPs,如IL-1β、IL-6和MCP-1(图3F-H)。结果显示,CD38-ARM-MSC-EVs可靶向CD38highA549细胞并使其恢复活力,还能协同增强NMN的抗衰老作用。

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图3 CD38-ARM-MSC-EVs靶向衰老A549细胞并使其恢复活力

 

04

CD38-ARM-MSC-EVs可恢复衰老A549细胞的NAD+水平并逆转EMT

CD38在衰老过程中会增加,降低NAD+水平,并以依赖SIRT的方式导致线粒体功能障碍。为了证实CD38-ARM-MSC-EVs对衰老的AEC2A549细胞中NAD+水平和代谢的影响,我们评估了NAD+和NAMPT、SIRT1和SIRT3的水平,并根据活性氧(ROS)水平和线粒体膜电位评估了线粒体功能。发现CD38-ARM-MSC-EVs比未修饰的MSC-EVs更能逆转NAD+的下降,而且无论是否与NMN结合,CD38-ARM-MSC-EV在NAD+调节方面都具有潜在的优势(图4A-F)。

EMT是PF的一个主要特征,其中衰老调节PF相关细胞因子的分泌,从而促进EMT,导致胶原沉积和纤维化形成。本研究发现,与PBS对照组相比,CD38-ARM-MSC-EVs可抑制衰老A549细胞的EMT。NMN也抑制了EMT,减少促纤维化细胞因子的分泌,而CD38-ARM-MSC-EVs协同增强了NMN对PF相关细胞因子的表达水平的影响,而未修饰的MSC-EVs对PF相关细胞因子的表达则不起作用(图5A和5B)。CD38-ARM-MSC-EVs与NMN联合使用时,对PF相关细胞因子的影响比为修饰的MSC-EVs更强。

这些研究结果表明,CD38-ARM-MSC-EVs可恢复NAD+水平、逆转线粒体功能并调节衰老A549细胞的EMT,与未修饰的MSC-EVs相比,CD38-ARM-MSC-EVs在体外抗衰老和抗纤维化方面具有更大的潜力。

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图4 CD38-ARM-MSC-EVs可恢复衰老A549细胞的NAD+水平并逆转EMT

 

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图5 CD38-ARM-MSC-EVs在衰老A549细胞中逆转EMT

05

CD38-ARM-MSC-EVs在自然衰老小鼠中靶向AEC2

接下来,作者研究了CD38-ARM-MSC-EVs是否能在体内靶向CD38high细胞,通过免疫组化和免疫荧光染色检测,与年轻小鼠(3个月)相比,老龄小鼠(17个月)肺、肝和脾组织中的CD38表达升高,而心脏和肾组织则没有出现这些变化(图6A)。为了更好地了解EVs在老年小鼠体内的生物分布,我们分别给年轻小鼠和老年小鼠腹腔注射了DiR标记的CD38-ARM-MSC-EVs和未修饰的MSC-EVs。为了确保向组织提供足量的EVs,我们将EVs的剂量增加到150μg,并将检测时间延长到24h,结果观察到两种类型的EVs在两种类型的小鼠中都主要积聚在脾脏和肝脏,而不是肺脏(见图6B和6C)。在老龄小鼠中,与未修饰的MSC-EVs相比,CD38-ARM-MSC-EVs在肝脏中的保留率更高,组织切片分析显示,CD38-ARM-MSC-EVs在CD38high组织,如肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中富集得更明显(图6D、6E)。因此,在肺组织切片的CD38阳性细胞和SP-A阳性AEC2中发现的CD38-ARM-MSC-EVs多于未修饰的MSC-EVs(图6F-I)。

因此,与MSC-EVs相比,CD38-ARM-MSC-EVs更倾向于积聚在CD38阳性组织中,并靶向老年小鼠的AEC2。

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图6 CD38-ARM-MSC-EVs可靶向自然衰老小鼠体内的CD38high细胞和AEC2s

 

06

CD38-ARM-MSC-EVs缓解多种与年龄相关的小鼠表型

       鉴于CD38在抗衰老治疗中的靶向作用,作者接下来确认了CD38-ARM-MSC-EVs是否能减轻小鼠与年龄相关的表型,并与具有抗衰老作用的药物NMN显示出显著的协同效应。将17个月大的C57BL/6J小鼠被分为五个治疗组:MSC-EVs、CD38-ARM-MSC-EVs、NMN、MSC-EVs与NMN、CD38-ARM-MSC-EVs与NMN,并以PBS作为对照(图7A)。由于CD38-ARM-MSC-EVs可以在体外靶向衰老的AECA549细胞并使其恢复活力,所以重点研究了肺组织的变化。对照组衰老小鼠肺泡塌陷、肺间质增厚、炎症细胞大量浸润等紊乱的肺组织结构在所有治疗组中都得到了明显缓解(图7B)。此外,Masson三色染色显示,与衰老相关的PF有所减弱,SA-β-GAL和P21的免疫组化染色显示,与对照组相比,这两种衰老标志物在这些组中的表达明显减少(图7C-F)。为了进一步分析效果,我们对Ashcrof评分进行了条形图比较,结果显示,与对照组相比,CD38-ARM-MSC-EVs组的评分明显较低,而MSC-EVs组的评分较低,但无统计学意义。

在SA-β-GAL活性变化中也发现了这一现象,与MSC-EVs组相比,CD38-ARM-MSC-EVs组的活性显著降低。与对照组相比,NMN组的Ashcroft评分和SA-β-GAL活性的变化明显降低,两个组合组之间的降幅有数量上的差异,但无统计学差异(图7F、7G)。因此,CD38-ARM-MSC-EVs与MSC-EVs相比,能缓解与衰老相关的PF,并具有更多潜在的有益作用。

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图7 CD38-ARM-MSC-EVs可减轻自然衰老小鼠的肺纤维化

 

研究进一步检测了CD38-ARM-MSC-EVs对这些肺组织中NAD+代谢和EMT的影响。结果发现,与对照组相比,CD38-ARM-MSC-EVs能有效调节肺组织中的NAD+代谢,表现为NAD+、NADP、NAM和SIRT1水平的升高,而未修饰的MSC-EVs未能显著调节NADP和SIRT1的水平。两种类型的EVs在NAD+、NADP、NAM或SIRT1的水平上没有明显差异,尽管它们能明显增强NMN对NAD+和SIRT1水平的增加作用,但两组组合之间没有明显差异(图8A-C)。此外,与对照组相比,CD38-ARM-MSC-EVs能下调肺泡和支气管组织中α-SMA的表达水平,上调E-cad的表达水平;但MSC-EVs只能上调支气管组织中E-cad的表达水平;而且,两种类型的EVs之间没有差异。对于支气管组织中的α-SMA表达,CD38-ARM-MSC-EVs与NMN的作用明显增强,而MSC-EVs则没有。当与 NMN 结合使用时,这些 EVs 与 MSC-EVs 对任何 EMT 标志物的作用都没有明显差异(图 8D-G)。这些结果表明,CD38-ARM-MSC-EVs有可能增加NAD+水平并抑制老化肺组织上皮屏障的EMT,从而防止纤维化的发展。

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图8 CD38-ARM-MSC-EVs可逆转老龄小鼠肺组织中NAD+的下降并抑制EMT

 

研究结论

在这项研究中,作者使用装载了CD38抗原受体-CD8跨膜片段融合质粒的慢病毒转染间充质干细胞,成功构建了CD38-ARM-MSC-EVs。CD38-ARM-MSC-EVs 可靶向 CD38high细胞,使体外衰老的 AEC2 恢复活力,并在恢复 NAD+ 水平、减轻线粒体功能障碍和抑制 EMT ,同时减轻衰老小鼠的 PF。此外,CD38-ARM-MSC-EVs似乎比MSC-EVs显示出更多潜在的有益作用,并能协同增强 NMN的抗衰老和抗PF作用。

 

产品引用说明

本文检测SASP因子(包括IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1)和促纤维化因子(包括TGF-β、MMP2和MMP9)的水平均使用Bio-Swamp的ELISA试剂盒。列表如下:

名称 货号

Human Interleukin 1β(IL-1β)

ELISA Kit

HM10206

Human Interleukin 6(IL-6)ELISA Kit

HM10205

Human Tumor Necrosis Factor-α 

(TNF-α) ELISA Kit

HM10001

Human Monocyte Chemotactic 

Protein 1(MCP-1/CCL2)ELISA Kit

HM10894

Human Transforming Growth Factor-β

(TGF-β)ELISA Kit

HM10058

Human Matrix Metalloproteinase 2

(MMP-2)ELISA Kit

HM10737

Human Matrix Metalloproteinase 9

(MMP-9)ELISA Kit

HM10095

 

 

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