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IF:14.9

 

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骨替代物植入术已成为修复口腔颌面骨缺损的重要治疗策略，这项技术的成功依赖于成骨的诱导和局部免疫微环境的最佳调节。在以往研究中，炎症反应和免疫细胞被认为是影响植入材料生物学效应的不利因素。因此，该领域最热门的研究课题之一是开发和应用在局部微环境中最小化免疫反应和由此产生的炎症效应的生物材料。然而，根据最近在骨免疫学领域出现的观点，可植入骨替代材料与免疫系统之间的关系在成骨过程中起着重要的积极作用。也就是说，免疫细胞维持的免疫平衡决定了生物材料在复杂的体内环境中的最终结果，过度的免疫反应和不足的免疫反应都可能导致骨诱导失败。

作为一种广泛应用的植入性骨替代材料，双相磷酸钙（BCP）已被许多研究证实具有骨诱导作用。有研究表明，在炎症环境不足的情况下，如微创手术植入或T细胞缺陷，都会导致骨诱导失败。这一结果表明，适当的炎症反应，包括适应性免疫反应，是BCP的骨诱导所必需的。然而，作为一种非抗原性材料，BCP如何激活适应性免疫仍不清楚。

北京大学口腔医学院孙玉春教授团队，通过大量数据分析探讨了免疫系统与组织再生之间的相互作用，研究发现树突状细胞在骨替代材料介导的骨诱导过程中起关键作用。其研究结果揭示了骨替代材料植入后的免疫再生过程，为骨替代材料的发展指明了潜在的方向，为临床手术方法的发展提供了指导，相关研究成果在International Journal of Oral Science上发表原创性研究论文《Role of dendritic cells in MYD88-mediated immune recognition and osteoinduction initiated by the implantation of biomaterials》（树突状细胞在MYD88介导的免疫识别和生物材料植入引发的骨诱导中的作用）

 

  

研究结果

  

 

01 

树突状细胞DCs在BCP骨诱导中的作用

               

实验建立DCs缺陷小鼠BCP肌肉植入模型，收集腓肠肌组织样本进行组织学染色。结果显示，BCP植入4周后，对照组CD11c-DTR+PBS有明显的新骨形成(黄色区域)，而实验组CD11c-DTR+DT未检测到新骨形成(图1b,c)。CD11c-DTR+DT成骨标志物COL1A1的表达明显低于CD11c-DTR+PBS组(P=0.00014)(图1d,e)。这些结果表明，DCs的缺失直接阻碍了BCP的骨诱导作用。

图1  DC缺失对BCP骨诱导能力的影响

 

02 

创伤相关的BCP表面吸附物是激活DCs的关键

               

为了证实BCP激活DCs是否与植入手术创伤有关，实验对BCP颗粒进行处理，模拟降解引起的变化，在治疗中通过BCP颗粒的小创面植入(MW-BCP)或大创面植入(LW-BCP)评估创伤相关因素。研究结果表明，LW-BCP组和MW-BCP组的颗粒表面存在“吸附物质”，并且吸附物质的数量与植入创伤的严重程度显著相关(图2d,e)。进一步研究后，还发现BCP颗粒激活DCs的能力明显与植入创伤的严重程度有关。

图2  BCP激活DCs与植入创伤的严重程度的关系

 

为了进一步探讨吸附物质的作用，我们用PBS处理的BCP、MW-BCP和LW-BCP颗粒的洗脱液刺激DC2.4细胞24h，以检测DC的激活。免疫荧光（图3a）和流式细胞术（图3b，c）结果表明，与PBS处理的BCP组相比，在LW-BCP刺激下，DC活化标记物CD80、CD83和CD86的表达显著上调，但在MW-BCP刺激下，DC活化标记物CD80、CD83和CD86的表达不显著上调。这一结果证实，BCP颗粒激活DCs的能力明显也与材料表面吸附物质的数量有关。

图3  BCP的DC激活能力与种植创伤严重程度的关系

 

03 植入创伤产生的危险信号蛋白HMGB1在触发免疫识别中的作用               

实验制备LW-BCP和MW-BCP洗脱液，通过ELISA检测各种危险信号蛋白的浓度。在LW-BCP组和MW-BCP组之间，HMGB1和HSP60的浓度存在显著差异，但ATP和UA的浓度没有显著差异(图4a)，HSP60浓度明显低于HMGB1浓度(图4b)。通过对HMGB1进行免疫组化染色，发现HMGB1确实存在于BCP表面的吸附物质中(图4c)。流式细胞术结果也证实，BCP浸泡在HMGB1中显著提高了DCs的活性(P<0.0001)(图4d,e)。这些结果表明，HMGB1可能是植入生物材料免疫激活的最关键分子。

图4  HMGB1在BCP表面的吸附及DCs免疫激活

 

04 

TLR4/MYD88/NF-κB在树突状细胞识别生物材料中的作用

               

本研究蛋白-蛋白相互作用分析表明，HMGB1主要通过TLR4-MYD88信号通路激活免疫识别过程(图5a)。LW-BCP洗脱液处理的细胞中，TLR4/MYD88/NF-κB信号轴显著上调(图5b)，TLR4和跨膜蛋白MYD88的表达以及核NF-κB-p65的表达均显著上调(图5c,d)。这些结果表明HMGB1被吸附在生物材料表面，通过TLR4/MYD88/NF-κB信号通路激活DCs。

图5  树突状细胞通过TLR4/MYD88/NF-κB信号轴识别生物材料

 

05 

活化的DCs促进MSCs募集

               

用BCP和LW-BCP培养液处理DCs，然后将处理后的DCs与原代BMSCs共培养。用NF-κB信号通路抑制剂PDTC处理DCs，以阻断LW-BCP组DCs的激活。实验结果表明，活化的DCs通过促进MSCs的募集参与骨再生过程，而不是直接诱导MSCs的成骨分化(图6e)。

图6  通过激活TLR4/MYD88/NF-κB信号轴促进MSC募集

 

06 

MYD88介导的免疫识别在BCP成骨能力中的作用

               

利用MYD88-KO小鼠验证DCs介导的免疫识别信号通路在成骨过程中的重要性。H&E和Masson染色显示，BCP植入4周后，MYD88-KO小鼠未见新骨形成(图7a、b)。IHC染色观察MYD88-KO小鼠MSCs的募集情况，结果证实MYD88-KO小鼠BCP周围的MSCs总数或成骨分化MSCs数量明显少于WT小鼠(图7c-f)。这些结果证实MYD88介导的树突状细胞免疫识别对于BCP骨诱导是必要的。

图7  MYD88-KO小鼠中BCP的骨诱导和MSC募集能力

 

研究结论

  

本研究揭示了骨替代材料植入后的免疫再生过程，强调了树突状细胞在BCP骨诱导过程中的重要作用，探讨了非抗原生物材料激活机体自然免疫和适应性免疫的机制，发现与材料植入相关的手术创伤会引起细胞坏死，从而导致高迁移率基团蛋白-1(HMGB1)的释放，该蛋白被吸附在骨替代材料表面。HMGB1吸附的物质被树突状细胞的TLR4-MYD88-NFκB信号轴识别，炎症反应被激活。活化的树突状细胞释放再生相关的趋化因子，招募间充质干细胞，并启动骨诱导过程。这一发现为骨替代材料的研究、开发和应用提供了新的思路。

    

 

产品引用说明

文中检测HMGB1、(HSP)-60、ATP的表达水平采用了Bioswamp®贝茵莱试剂盒

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产品名称&货号： 

• Mouse HMGB1 ELISA Kit （MU30043）

• Mouse heat shock protein (HSP)-60 ELISA Kit （MU30603） 

• Mouse adenosine triphosphate (ATP) ELISA Kit（MU32950） 

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