原因分析

解决办法

信号补偿不正确

检查流式细胞仪上单色阳性对照是否设置正确；

检查门控和补偿设置是否正确。

检测的抗体不足

增加抗体量或抗体浓度。

无法接近

细胞内靶标

检查靶蛋白是否是位于细胞内;

膜蛋白的抗体表位是否位于细胞内。

荧光染料结合

分子太大

细胞内染色实验应使用小分子量的荧光染料。

激光器未对齐

确保流式细胞仪上的激光器正确对齐。

靶蛋白不存在/

低水平表达

确保正在分析的组织/细胞类型能表达靶蛋白，且靶蛋白的量足以被检出。

补偿过高/

增益过低

使用阳性对照正确设置流式细胞仪，利用补偿确保细胞的荧光信号不被切断，提高增益以增强信号。

荧光染料的荧光淬灭

抗体存放太久或没有避光保存，使用新鲜抗体配置。

一抗和二抗

不匹配

使用对应种属的一抗和二抗。

原因分析

解决办法

抗体浓度过高

减少每个样本中添加的抗体量。

过量抗体被捕获

确保洗涤步骤充分。

封闭不足

在抗体混合液中加入1%-3%封闭剂，并增加封闭时长。

原因分析

解决办法

增益设置过高/补偿过低

使用阳性对照正确设置流式细胞仪；使用补偿减少小颗粒背景信号并减少增益。

抗体过量

降低抗体浓度；

在洗涤缓冲液中添加去污剂。

原因分析

解决办法

表达靶蛋白的细胞群不止一个

检查样本包含的细胞类型的预期蛋白表达水平；

确保细胞充分分离。

出现细胞双峰

染色前混匀；

筛选或过滤细胞，去除团块。

原因分析

解决办法

细胞裂解

确保样品新鲜；

确保样本中的细胞没有裂解和破碎；

不要在高转速的情况下对细胞进行离心或激烈涡旋。

细菌污染

确保样本不受污染。

原因分析

解决办法

细胞聚集

阻塞管道

染色前混匀；

筛选或过滤细胞，以去除团块。

细胞数量

过少/过多

运行1 × 10⁵ 至1 × 10⁶ 个细胞/mL。