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IF:10.2

 

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伤口愈合是全球糖尿病患者主要健康问题之一。促炎M1巨噬细胞的过度激活可能导致糖尿病伤口愈合延迟。4-辛酯衣康酸(4OI)是衣康酸代谢物的衍生物，由于其优异的抗炎性能，近年来引起了人们越来越多的关注。在生物医学应用中，细胞膜涂层作为一种新的仿生策略被广泛认为可以传递药物并继承源细胞的特性。

 

华中科技大学同济医学院附属协和医院陈璐璐教授团队，通过大量研究，将诱导多能干细胞衍生的内皮细胞(iEC)膜与M1型巨噬细胞膜融合，构建了一种伪装4OI纳米囊泡的杂交膜(iEC-m) (4OI@iEC-M)。生物激发纳米囊泡4OI@iEC-M被纳入可注射的多功能明胶甲基丙烯酰水凝胶中，用于糖尿病伤口修复和再生。该研究成果于2023年10月在Journal of Nanobiotechnology期刊上发表题为《Bioinspired nanovesicles released from injectable hydrogels facilitate diabetic wound healing by regulating macrophage polarization and endothelial cell dysfunction可注射水凝胶释放的生物激发纳米囊泡通过调节巨噬细胞极化和内皮细胞功能障碍促进糖尿病伤口愈合》的原创性论文。

 

 

研究背景

  

糖尿病是一种慢性代谢性疾病，约25%的糖尿病患者存在包括糖尿病足溃疡(DFUs)在内的慢性不愈合伤口的显著风险，从而导致截肢。与正常伤口不同，糖尿病伤口由于糖脂代谢紊乱、缺血缺氧和持续的炎症反应，往往难以愈合。炎症对身体起着生理保护作用，可以防止进一步的损伤并清除受损组织。然而，不受控制的炎症会阻碍糖尿病患者的伤口愈合，包括巨噬细胞、中性粒细胞等失调。在糖尿病创面微环境中，促炎表型(M1)巨噬细胞继续占主导地位，抗炎表型(M2)巨噬细胞数量不足。巨噬细胞通过避免感染、清除受损组织和分泌细胞因子参与伤口愈合和修复的每个阶段。

巨噬细胞是减少炎症和促进慢性伤口愈合的最具吸引力的治疗靶点，诱导M2巨噬细胞极化和预防炎症的治疗策略引起了越来越多的关注。最近有报道称，代谢中间体在组织修复中发挥了重要作用。衣康酸4-辛酯(4OI)是衣康酸的衍生物，由于其优异的抗炎特性，4OI是一种很有前景的糖尿病伤口修复治疗物质，然而，以往的4OI递送试验非常有限，缺乏针对性。因此，迫切需要一个完善的递送系统，将4OI有效地递送到M1巨噬细胞中，并维持其抗氧化和抗炎作用。

细胞膜涂层作为一种仿生策略，可以使生物材料具有源细胞的特性和功能。细胞膜伪装的纳米囊泡，由于其膜抗原和结构，具有同源靶向、长血液循环和免疫逃逸等功能。为了实现巨噬细胞极化和内皮细胞功能障碍的双重调控，需要巨噬细胞靶向和内皮靶向同时进行。诱导多能干细胞(iPSC)衍生的内皮细胞(iECs)在EC相关基因表达方面与内皮细胞(ECs)表现出高度的相似性，iECs生物激发纳米囊泡能保留iECs的膜特性，具有ECs的特征，在同源靶向方面很有前景，因此，本研究使用了iEC膜和M1型巨噬细胞膜来研究纳米囊泡4OI@iEC-M对糖尿病伤口愈合的作用效果。

 

  

研究结果

  

 

01 

生物激发纳米囊泡4OI@iEC-M的制备

               

研究展示了iEC-M杂交膜包被的4OI生物激发纳米囊泡4OI@iEC-M的制备。透射电子显微镜(TEM)图像显示4OI@iEC-M具有特征性的核壳结构。iEC-M纳米囊泡与细胞孵育后，通过iEC-M组FITC和DiD染料的荧光，在细胞中显示出显著的共定位，证实了两种不同细胞类型的细胞膜杂交融合。动态光散射(DLS)实验和SDS-PAGE结果也进一步证明了杂交膜囊泡的成功制备。

 

 

02 

4OI@iEC-M对巨噬细胞和内皮细胞的双靶向作用

               

研究进一步探索了4OI@ iEC-M的双靶向作用，杂交膜纳米囊泡可以保留细胞膜蛋白，从而获得源细胞的功能。实验分别用4OI@iEC、4OI@M和4OI@iEC-M孵育HUVECs和RAW细胞，检测荧光强度。结果表明，杂交膜纳米囊泡可以靶向两种细胞类型，具有双重靶向作用。本研究首次将杂交膜纳米囊泡用于糖尿病伤口，并证明了纳米囊泡具有多种功能的双重靶向作用。

 

 

03 生物激发纳米囊泡可注射水凝胶4OI@iEC-M/GeIMA               

GelMA被认为是生物医学应用中具有代表性的水凝胶配方。在凝胶过程中，GelMA或4OI@iEC-M/GelMA溶液在波长为405 nm的光下交联30秒，扫描电镜(SEM)显示了水凝胶的孔隙形态。GelMA和4i @ iEC-M/GelMA水凝胶具有明显的多孔结构。两组的孔隙大小无差异。在伤口愈合过程中，水凝胶孔在营养交换中起着重要作用。通过高分辨率扫描电镜，我们可以观察到水凝胶中的纳米囊泡，证实4OI@iEC-M被成功加载到水凝胶中。OI@iEC-M/ GelMA元素映射图显示，C、N和O元素信号均匀分布在凝胶中，这进一步表明4OI@iEC-M被装载在GelMA水凝胶中。

适当的组织粘连是伤口敷料的关键。通过研究4OI@iEC-M/GelMA的注射性发现，4OI@ iEC-M/GelMA水凝胶可以紧密粘附在手指上而不释放，球形水凝胶可以重塑为六边形水凝胶，经过压缩和拉伸后可以恢复到原来的状态，柔韧性好。PBS中GelMA和4OI@iEC-M/GelMA的溶胀率呈现相同的趋势。因此，4OI@iEC-M纳米囊泡的引入提高了溶胀率，可通过吸收体液促进伤口愈合。所有的水凝胶都随着时间的推移而降解，15天后剩余重量约为40-50%。

实验进一步研究了4OI@iEC-M的载药效率和载药量，考虑到药物的负载效率和负载能力，发现制备4OI@iEC-M的最佳条件为0.024 mg 4OI与0.1 mg iEC-M反应(4OI/iEC-M=0.24)。进一步检测4OI@iEC-M在GelMA中的释放能力发现，渗透压和pH值对于维持细胞稳态和细胞膜选择性通透性很重要，强酸或高糖环境可能破坏细胞膜成分，导致细胞膜失去选择性通透性。因此，在酸性和高糖环境下，糖尿病创面可加速4OI@ iEC-M的释放。

 

 

04 

4OI@iEC-M/GeIMA对炎症和巨噬细胞极化的调节作用

               

炎症期延长是糖尿病创面愈合的主要挑战。实验研究了4OI@iEC-M/GelMA在高糖棕榈酸处理下对炎症和巨噬细胞极化的调节作用，在水凝胶体系上给予细胞处理。结果证实了4OI@iEC-M/GelMA组M2/M1巨噬细胞比率在所有组中最高。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)研究M2细胞因子(抗炎IL-10)和M1细胞因子(促炎IL-6)的表达，4OI@iEC-M/GelMA组IL-6蛋白水平降低，而IL-10蛋白水平升高高于其他组。说明4OI@ iEC-M/GelMA水凝胶可能通过调节炎症促进创面愈合。

在正常伤口中，从伤口愈合的第1天到第3天，巨噬细胞中的m1表型占主导地位，然后开始向M2型巨噬细胞过渡，并在第7天左右达到峰值;而在糖尿病伤口中，主要表型一直是M1，导致伤口修复受损，血管生成减弱。4OI@iEC-M/GelMA对M1和M2巨噬细胞比例的调节作用使该系统不仅在炎症调节方面有前景，而且在随后的血管生成改善方面也有前景。

 

 

05 

4OI@iEC-M/GeIMA促进内皮细胞的功能和血管生成

               

研究进一步评估了该递送系统在体外和体内的生物相容性。与4OI/GelMA组相比，4OI@iEC-M/GelMA组有更多的管状结构和数量。Transwell实验显示，与4OI/GelMA组相比，4OI@iEC-M/GelMA的迁移率更高。综上所述，4OI@iEC-M/GelMA显著促进了高糖和棕榈酸处理下HUVECs的功能和血管生成，内皮细胞功能增强和血管生成可促进糖尿病创面愈合。

 

 

06 

4OI@iEC-M/GeIMA促进体内糖尿病创面愈合

               

进一步研究4OI@iEC-M/GelMA在体内促进糖尿病创面修复的调节作用，结果表明4OI@iEC-M/GelMA水凝胶能够显著促进糖尿病创面愈合。所有组在第9天都观察到新形成的表皮，4OI@iEC-M/GelMA处理下的表皮比其他系统更自然、更成熟。H&E染色表明4OI@iEC-M/GelMA处理导致了更好的伤口愈合率，表皮和真皮组织的再生得到了改善。4OI@iEC-M/GelMA治疗比其他治疗导致更多的胶原沉积(蓝色)。因此，4OI@iEC-M/GelMA水凝胶通过促进表皮和真皮组织的再生和增加胶原沉积来改善糖尿病伤口修复。

 

07 

体内炎症和血管生成调节效应

               

在伤口愈合过程中巨噬细胞对皮肤修复非常重要，其中包括促炎M1和抗炎M2巨噬细胞。双免疫荧光染色研究了M2 (CD163)和M1巨噬细胞(iNOS)的比例。4OI@iEC-M/GelMA组观察到更多的M2和更少的M1巨噬细胞，这表明糖尿病伤口的炎症反应减少。4OI@iEC-M/GelMA组IL-6和IL-10的表达最低，炎症迹象较少。这些结果表明4OI@iEC-M/GelMA水凝胶可以有效减少炎症，进一步促进糖尿病创面愈合。

血管生成在伤口愈合的重塑阶段至关重要。CD31是血管生成过程中内皮细胞的典型标志物，利用CD31和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的双免疫荧光染色分析新生血管形成，OI@iEC-M/GelMA处理较其他处理显著提高了CD31和α-SMA的表达，因此，4OI@iEC-M/GelMA水凝胶具有促进血管形成的能力，从而有效促进糖尿病创面愈合。

 

 

研究结论

  

本研究将诱导多能干细胞衍生的内皮细胞(iEC)膜与M1型巨噬细胞膜融合，构建了一种伪装4OI纳米囊泡的杂交膜(iEC- m) (4OI@iEC-M)。生物激发纳米囊泡4OI@iEC-M被纳入可注射的多功能明胶甲基丙烯酰水凝胶中，用于糖尿病伤口修复和再生。该团队研究发现，生物激发纳米囊泡可以实现4OI对M1巨噬细胞和内皮细胞的双靶向递送，从而促进巨噬细胞极化，保护内皮细胞。纳米微泡负载水凝胶具有协同抗炎和免疫调节作用，可促进新生血管的形成，并具有良好的糖尿病伤口修复和再生能力。本研究可能为促进糖尿病创面修复提供一种新的策略，从而减少糖尿病的截肢和死亡率。

    

 

产品引用说明

文中检测IL6和IL10的表达水平采用Bioswamp®贝茵莱试剂盒

 

产品名称&货号： 

• Mouse Interleukin6（IL-6）ELISA Kit & MU30044

• Mouse Interleukin 10（IL-10）ELISA Kit & MU30055

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贝茵莱产品优势： 

 

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