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IF:13.2

 

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论文中检测TRIM4 的表达水平采用了Bioswamp®贝茵莱抗体Bioswamp®TRIM4 Polyclonal Antibody，货号：PAB32752。

 

甲型流感病毒(IAV)是一种具有8段基因组的单链（-）RNA病毒，给全球畜牧业造成巨大的经济损失，其中越来越多的禽流感亚型获得了跨越物种屏障感染人类的能力，并导致人类呼吸道疾病和死亡。IAV基因组编码10种必需蛋白和多达8种辅助蛋白，病毒基因组RNA（vRNA）与三个聚合酶亚基（聚合酶碱性蛋白2（PB2）/聚合酶碱性蛋白1（PB1）/聚合酶酸性蛋白（PA）和核蛋白（NP）结合）形成病毒核糖核蛋白（vRNP）复合物。IAV的复制周期涉及与大量宿主细胞蛋白和RNA的复杂相互作用，这决定了病毒的致病性和传播性，其基因组的转录和复制发生在感染细胞的细胞核内，病毒感染后，vRNP复合体被转运到细胞核中，随后在宿主细胞内发生复制繁殖行为。参与这一过程的宿主因子可作为制定IAV感染对策的目标，一些宿主因子已被确定参与调控vRNP或新合成NP进入感染细胞细胞核的转运，本研究新发现宿主锚蛋白重读序列（Ankyrin Repeat, ANK）和BTB Domain Containing1（ABTB1）能促进IAV的复制，分子实验证实了ABTB1在促进vRNP复合物的核输入中起间接作用。

研究团队从vRNP入核行为入手，解释其中行为发生的机制，用于制定对抗IAV感染的对策。相关研究成果《ABTB1 facilitates the replication of influenza A virus by counteracting TRIM4-mediated degradation of viral NP protein》（ABTB1 通过抵消 TRIM4 介导的病毒 NP 蛋白降解促进甲型流感病毒的复制）发表在Emerging Microbes & Infections上。

 

  

研究结果

  

 

01 

ABTB1正调控IAV复制

               

通过使用具有复制能力的Venus表达H5N1病毒（H5N1，NA-Venus）在靶向21585个mRNA的全基因组siRNA文库中筛选，发现ABTB1是IAV复制的潜在原宿主因子。为了证实ABTB1确实参与了IAV的复制，学者在A549细胞中进行siRNA基因沉默实验，下调ABTB1的表达，随后用A/WSN/33（WSN，H1N1）（MOI=0.01），A/Anhui/2/2005（AH05，H5N1）（MOI=0.1），A/chicken/Shanghai/SC197/2013（SH13，H9N2）（MOI=0.1）病毒感染细胞。RT-qPCR/WB结果显示siRNA有效沉默了ABTB1的表达，而且对细胞活力没有影响（图1A-C）。ABTB1的低表达，导致WSN（H1N1）、AH/05（H5N1）和SH/13（H9N2）病毒在感染后24h和48h（hpi）的生长滴度分别降低5.6-/7.5-（图1D）、14.6-/6.6-（图1E）和4.8-/6.5-倍（图1F），表明ABTB1对不同亚型IAV的有效复制很重要。

为了排除siRNA的脱靶效应的可能性，学者使用CRISPR/Cas9系统生成了ABTB1敲除（ABTB1_KO）A549细胞系（图1G-I），在ABTB1_KO A549细胞中生长的WSN（H1N1）病毒滴度在24h和48h分别比对照A549细胞下降了16倍和26倍（图1J），表明敲除ABTB1表达也显著抑制IAV复制。构建ABTB1过表达细胞，使病毒复制在24和48h增加了7.2和6.8倍（图1K-M）研究还证实IAV复制与ABTB1表达的关联性，发现ABTB1的水平在感染后6、12和24h时被显著诱导（图1N）。以上数据表明，ABTB1在IAV感染过程中具有重要的生物学意义，ABTB1是IAV复制的积极调节因子，可能在IAV生命周期中发挥重要作用。

图1 

 

02 

ABTB1参与IAV生命周期的早期阶段

               

为了探究ABTB1参与IAV生命周期的哪个阶段，学者将ABTB1_KO或对照A549感染WSN（H1N1）病毒（MOI=5），观察病毒NP的细胞分布，在4hpi时，对照A549细胞的细胞核中密集积累，但在ABTB1_KO细胞的细胞核中观察到较弱的病毒（图2A），结果表明敲除ABTB1阻碍了IAV复制周期的早期阶段。同时，在7hpi时，病毒NP已经定位在大多数对照细胞的细胞质中，表明核输出过程基本完成，而在ABTB1_KO细胞中呈现混合性分布：它仍然保留在某些细胞的细胞核中，而大多数仍未经过核输入过程。同样地，用小鼠抗NP抗体检测病毒NP蛋白在ABTB1_KO中的表达情况，并在2.、3、4和7hpi时用WSN(H1N1)(MOI=5)处理对照A549细胞，同对照相比，ABTB1_KO细胞中NP在不同时间点的表达水平降低（图2B-D）。以上结果表明，由于ABTB1基因的敲除导致病毒复制早期缺陷，与对照细胞相比，WSN（H1N1）病毒在ABTB1_KO细胞中的整体复制周期被延迟，证实ABTB1参与了IAV生命周期的早期阶段。

图2

 

03 ABTB1促进AV的vRNP复合物的核输入               

vRNP复合物进入受感染细胞的细胞核需要利用宿主内吞和细胞质运输机制，文中学者使用共聚焦显微镜来确定IAV生命周期中ABTB1发挥作用的具体过程。用WSN（H1N1）（MOI=20）感染ABTB1特异性siRNA沉默以及干扰siRNA沉默的A549细胞，发现WSN（H1N1）病毒与两组细胞表明结合良好，并且被有效地内化到细胞中（图3A），表明ABTB1沉默表达对IAV的受体结合和内吞作用没有影响。学者使用R18（十八烷基罗丹明B氯，红色）和DiOC（3,3=-二十八烷基-5,5=-二(4-璜苯基)草碳菁，绿色）生成双标记病毒来定量测量融合过程。在膜融合过程之前，R18猝灭了DiOC的荧光；当膜融合发生时，DiOC和R18扩散到内体膜中，从而停止了猝灭过程，此时可以检测到DiOC荧光。转染了靶向vATPase亚基vATP6V1B2的siRNA的A549细胞，在IAV进入宿主细胞中起重要作用的阳性对照，在3 hpi时显示出很少的融合位点(图3B)。相比之下，在转染靶向ABTB1的siRNA或干扰siRNA的A549细胞中观察到大量融合位点，表明ABTB1不影响IAV进入的融合过程。IAV的剥膜过程以vRNP复合物与M1的解离为特征，使复合物释放到细胞质中。为了确定ABTB1是否参与了IAV的剥膜过程，在环已酰亚胺(CHX)存在的情况下，将转染了靶向ABTB1或vATP6V1B2的siRNA，或转染了干扰siRNA的A549细胞感染WSN (H1N1)（MOI=100）病毒，在3 hpi时，将感染的细胞固定，用兔抗M1抗体染色，用共聚焦显微镜观察M1的细胞分布。vatp6v1b2敲除的细胞在细胞质中表现出M1聚集，表明vRNP复合物解离的过程在M1阶段被抑制(图3C)。在CHX处理下，M1分散在转染了靶向ABTB1的siRNA或干扰siRNA的A549细胞的细胞质中，表明脱膜过程完成(图3C)。总的来说，在ABTB1特异性siRNA处理和干扰siRNA处理的A549细胞中，M1的细胞分布没有差异。这些数据表明ABTB1在IAV进入的剥膜过程中没有作用。

为了研究 ABTB1 是否参与了传入的 vRNP 复合物的核输入，在 CHX 存在的情况下，用靶向 ABTB1 的 siRNA 或干扰的 siRNA 转染的 A549 细胞感染 WSN （H1N1）（MOI=50） 病毒。在 3、4 和 5 hpi 时，固定感染细胞并用小鼠抗 NP mAb 染色，并通过共聚焦显微镜观察 NP 的细胞分布。与干扰的siRNA处理的细胞相比，ABTB1低表达的细胞显示出NP的核定位明显减少（图3D）。在CHX存在下，与感染WSN（H1N1）病毒（MOI = 50）的对照细胞相比，ABTB1过表达A549细胞中vRNP复合物的核输入显着增强（图3E）。总之，这些数据表明 ABTB1 在传入的 vRNP 复合物的核输入中起着重要作用。

图3

04 

TRIM4负向调控IAV的复制

               

IAV病毒进入感染细胞细胞核途径是由病毒NP与输入蛋白α同工型相互作用介导的，学者进行了CO-IP分析，探索ABTB1是否通过直接与NP相互作用在vRNP复合体的核输入中发挥作用，结果显示ABTB1与NP之间没有相互作用（图4A），且ABTB1有可能在vRNP复合体的核输入的促进作用中是起间接作用的。为此，学者通过免疫沉淀和质谱分析确定到TRIM4为潜在靶标（图4B），并且在感染WSN（H1N1）的A549细胞中，TRIM4的表达是响应表达的，而相同的干扰素β (IFN-β)却并不会诱导其表达，说明TRIM4蛋白与IAV核内复制有关，TRIM4蛋白分为TRIM4α、TRIM4β和TRIM4γ三个亚型，实验验证发现TRIM4β亚型在IAV感染刺激下响应表达最高，并且存在相互作用（图5A-F）。

图4

 

图5

 

为了研究TRIM4在IAV复制中的作用，检测了过表达TRIM4β对IAV的生长影响，在过表达的HEK293T细胞中，TRIM4β过表达导致WSN (H1N1)、AH05 (H5N1)和SH13 (H9N2)在24和48hpi生长强度分别降低了23-/65-、25-/50-、26-/40-倍（图6A-D），结果表明TRIM4负性调节IAV的复制。而在siRNA沉默和CRISPR基因敲除TRIM4基因的A549细胞系中，WSN（H1N1）在24和48hpi时生长滴度增加了12和3倍（图6E-J）。综上所述，这些数据表明TRIM4负调控IAV的复制。

图6

 

05 

TRIM4β抑制IAV vRNP复合物的核输入

               

探索TRIM4β相关的IAV复制周期，将过表达TRIM4β的HEK293T细胞感染WSN（H1N1）（MOI=5），在指定的时间点观察NP的表达与定位，在3hpi时，NP明显聚集在对照细胞的细胞核中，而过表达的细胞中，NP时微弱的检测到，表明病毒在生命周期的早期阶段倍阻断（图7A），而在7hpi时，对照细胞的细胞核和细胞质中都检测到NP，相比之下，过表达的细胞质中只在细胞质中检测到微弱的NP。而在基因敲除的TRIM4_KO细胞中，在2、3、4和7hpi时，TRIM4_KO A549细胞的NP核积累更清晰，病毒生命周期的总体进展加快（图7B）。结果表明，TRIM4负向调节IAV vRNP复合物的核输入。

图7

 

06 

TRIM4通过K48连接的泛素化蛋白酶体靶向降解病毒NP

               

共表达TRIM4β，能够明显抑制NP的核积累，同时与病毒NP共定位在细胞质中（图8A-B），用表达 Flag-TRIM4β 的构建体转染 HEK293T 细胞 24 小时，然后用WSN（H1N1）（MOI = 5）感染。在6和10hpi时，将细胞固定并进行共聚焦显微镜检查。在强烈表达 TRIM4β 的细胞中检测到的 NP 非常微弱（图8C），表明由于 TRIM4β 在此类细胞中的有效表达，传入的 vRNP 复合物和新合成的 NP 中的 NP 被破坏，在HEK293T细胞中，通过增加Flag-TRIM4β的量，NP水平逐渐降低，也证实了这一说法，同时，Flag-TRIM4β的量也对IAV的其它亚型NP积累具有明显的抑制作用（图8D-G）。TRIM4是一种已建立的泛素E3连接酶，可能对NP的降解作用是通过介导E3泛素化降解的，在研究中，学者通过加入MG132泛素化抑制剂，显著抑制了NP的降解（图8H）。鉴于通过泛素化降解的蛋白大多是通过Lys48（K48）连锁修饰，研究补充K48泛素表达对NP的降解影响，不论是过表达K48泛素还是Myc-TRIM4β，都对NP的降解作用更为显著，而且在MG132存在的情况下，感染细胞中K48连锁NP泛素化倍检测到（图8I-J）。总之，这些结果表明TRIM4β通过K48连接的泛素化和蛋白酶体靶向降解不同IAV亚型的NP。

图8

 

研究结论

  

本研究揭示了骨替代材料植入后的免疫再生过程，强调了树突状细胞在BCP骨诱导过程中的重要作用，探讨了非抗原生物材料激活机体自然免疫和适应性免疫的机制，发现与材料植入相关的手术创伤会引起细胞坏死，从而导致高迁移率基团蛋白-1(HMGB1)的释放，该蛋白被吸附在骨替代材料表面。HMGB1吸附的物质被树突状细胞的TLR4-MYD88-NFκB信号轴识别，炎症反应被激活。活化的树突状细胞释放再生相关的趋化因子，招募间充质干细胞，并启动骨诱导过程。这一发现为骨替代材料的研究、开发和应用提供了新的思路。

    

 

产品引用说明

文中检测HMGB1、(HSP)-60、ATP的表达水平采用了Bioswamp®贝茵莱试剂盒

 

产品名称&货号： 

• Mouse HMGB1 ELISA Kit （MU30043）

• Mouse heat shock protein (HSP)-60 ELISA Kit （MU30603） 

• Mouse adenosine triphosphate (ATP) ELISA Kit（MU32950） 

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贝茵莱产品优势： 

 

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