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Bioswamp®贝茵莱生物为客户提供CXCR4、GSDMD、IL-1β的ELISA试剂盒和GAPDH Monoclonal Antibody等抗体产品，列表如下：

基因名称	货号
Human Chemokine Cxc Receptor 4 （CXCR4）ELISA Kit	HM11048
Human Gasdermin D（GSDMD） ELISA Kit	HM12089
Human Interleukin 1β（IL-1β）ELISA Kit	HM10206
GAPDH Monoclonal Antibody	MAB45855

 

研究结果

动脉瘤性蛛网膜下腔出血(SAH)是卒中的一种亚型，致残率和死亡率较高，SAH术后3天内早期脑损伤(EBI)是导致SAH死亡率高、预后差的主要原因。以常驻小胶质细胞活化、炎症细胞浸润和细胞因子释放为特征的先天炎症在SAH后EBI的发病机制中起重要作用。由此认为减少神经炎症是减少EBI和促进SAH后神经恢复的一种有希望的方法。

焦亡被认为是SAH后EBI的一个重要且具有破坏性的病理生理过程。布鲁顿酪氨酸激酶(Bruton’s tyrosine kinase, BTK)是B细胞受体功能和信号转导的关键调节因子，BTK磷酸化在调节NLRP3炎性小体形成和焦亡过程中发挥了多种作用。多项研究表明BTK具有抗炎作用，BTK磷酸化在调节NLRP3炎性小体形成和焦亡过程中发挥了多种作用。趋化因子参与调节神经炎症，CX-C趋化因子受体4型(CXCR4)在免疫细胞和造血细胞中表达，有研究发现抑制CXCR4可减轻小鼠脑卒中后小胶质细胞活化、神经炎症和焦亡，改善神经功能，其改善神经炎症的作用机制尚不清楚。因此进一步探索CXCR4和BTK在SAH后小胶质细胞活化和焦亡中的作用是有必要的。

2023年11月，武汉大学人民医院李明昌团队，阐明了CXCR4和BTK在蛛网膜下腔出血(SAH)后早期脑损伤(EBI)发病机制中的神经炎症作用，并在生物医学领域的top期刊《Redox Biology》（IF:11.4，中科院1区）发表了题为“CXCR4-BTK axis mediate pyroptosis and lipid peroxidation in early brain injury after subarachnoid hemorrhage via NLRP3 inflammasome and NF-κB pathway  (CXCR4-BTK轴通过NLRP3炎性体和NF-κB途径介导蛛网膜下腔出血后早期脑损伤的焦亡和脂质过氧化)”的原创性研究论文。

 

研究结果

 

01

CXCR4和p-BTK在SAH后的作用

为了证实CXCR4和p-BTK在SAH后的作用，我们测量了血管内穿孔法建立的SAH小鼠模型同侧皮质组织和hemin处理的小胶质细胞中CXCR4、p-BTK和BTK的蛋白水平。结果如图1所示，与假手术小鼠相比，SAH小鼠小胶质细胞中CXCR4或p-BTK的表达增加。在体外，用hemin处理BV2细胞24h后，CXCR4和p-BTK的表达水平也显著上调。

图1  SAH小鼠和hemin处理的小胶质细胞同侧皮质中

CXCR4和p-BTK的表达水平升高

 

02

SAH小鼠腹腔注射Ibrutinib作用显著

为了评估p-BTK在SAH后EBI中的作用，小鼠在SAH后立即腹腔注射Ibrutinib（一种BTK磷酸化的特异性抑制剂）。结果如图2所示，与假手术小鼠相比，SAH小鼠神经学评分显著降低，左、右半脑含水量明显增加，MDA水平增加，SOD和GSH-Px活性降低，NOX2、p-P65、IL-1β、IL-18和TNF-α的表达显著升高。与SAH小鼠相比，Ibrutinib处理可显著改善神经功能缺陷，减轻脑水肿，降低SAH小鼠MDA水平，增加SOD和GSH-Px活性，抑制NOX2、p-P65、IL-1β、IL-18和TNF-α的表达，提高存活率。

图2 抑制BTK磷酸化可减轻SAH小鼠的神经损伤、脂质过氧化和神经炎症

 

03

抑制BTK磷酸化缓解SAH后神经损伤

为了在体内进一步探究抑制BTK磷酸化缓解SAH后神经损伤的机制，本研究对血脑屏障通透性及相关指标进行了检测。结果如图3所示，与假手术小鼠相比，SAH小鼠同侧皮质中发现occludin和ZO-1的表达降低，EB外渗显著增加，大脑显示出明显的组织损伤和神经元死亡，Nissl阳性细胞数量明显减少。与SAH小鼠相比，Ibrutinib处理可显著上调occludin和ZO-1的表达，减少双脑EB染料泄漏，改善神经元损伤，减少神经元死亡数量。

图3 抑制BTK磷酸化可降低SAH小鼠血脑屏障通透性改善神经元损伤

 

04

Ibrutinib处理对小胶质细胞极化的影响

为了在体外证实抑制BTK磷酸化缓解hemin诱导BV2细胞损伤的作用机制，本研究评价了Ibrutinib处理对小胶质细胞极化的影响。结果如图4所示，与未处理的BV2细胞相比，hemin处理后细胞活力降低，NOX2、pP65、IL-1β、IL-18和TNF-α的表达升高，p-P65、IL-1β、TNF-α和iNOS的表达增加，细胞向M1表型极化。与hemin处理的BV2细胞相比，Ibrutinib处理可显著提高细胞活力，下调NOX2、pP65、IL-1β、IL-18和TNF-α的表达，上调Arg1和CD206的表达，下调pP65、IL-1β、TNF-α和iNOS的表达，促进细胞向M2表型极化。

图4 抑制BTK磷酸化通过促进hemin诱导BV2细胞向M2型极化缓解炎型损伤

 

05

抑制BTK磷酸化缓解SAH后神经炎症的机制

为了在体外确认抑制BTK磷酸化缓解SAH后神经炎症的机制，本研究利用COIP技术鉴定了p-BTK与NLRP3的相互作用，并探究了BKT磷酸化在细胞焦亡中的作用。结果如图5所示，p-BTK与NLRP3直接相关，抑制p-BTK可以调节NLRP3炎症小体的激活。与hemin处理的BV2细胞相比，Ibrutinib处理可以显著降低hemin处理的BV2细胞中焦亡相关蛋白NLRP3、ASC、caspase-1和GSDMD-N的表达水平，提高SOD活性，降低ROS水平。

图5抑制BTK磷酸化可改善hemin处理BV2细胞的焦亡和脂质过氧化

 

06

检测了SAH小鼠脑皮质焦亡相关蛋白的表达

        为了在体内进一步证实BTK磷酸化在焦亡中的作用机制，本研究检测了SAH小鼠脑皮质焦亡相关蛋白的表达。结果图6所示，与假手术小鼠相比，SAH小鼠脑皮质中p-BTK、NLRP3、ASC、caspase-1和GSDMD-N的表达显著上调，神经元和小胶质细胞中NLRP3的表达明显升高。与SAH小鼠相比，Ibrutinib处理可抑制NLRP3炎性体的形成，减少焦亡。

图6抑制BTK磷酸化可减少SAH小鼠的焦亡

07

NLRP3在SAH后焦亡中的作用

        接下来，本研究利用NLRP3敲除小鼠探究了NLRP3在SAH后焦亡中的作用，结果如图7所示，与SAH小鼠相比，NLRP3敲除SAH小鼠Modified Garcia评分升高，左右脑含水量降低，同侧半球的EB外渗降低，ZO-1和occludin的表达升高，表明敲除NLRP3可以保护血脑屏障的完整性。同时，与SAH小鼠相比，NLRP3敲除显著降低同侧皮质焦亡相关蛋白caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL- 18的表达，表明NLRP3炎性体在SAH后的焦亡中起着至关重要的作用。

图7 NLRP3敲除可减少SAH小鼠的神经炎症和焦亡

 

08

CXCR4可能通过抑制BTK磷酸化来调节BV2细胞

        为了进一步探讨CXCR4在焦亡中的作用，本研究在体外使用CXCR4抑制剂AMD3100处理hemin处理过的BV2细胞，结果如图8所示，与hemin诱导的BV2细胞相比，AMD3100处理可以显著降低BTK和NF-κB和的磷酸化，下调NLRP3、ASC、p-P65、GSDMD-N、IL- 1β、IL-18和NOX2的表达水平，降低ROS水平，结果表明，CXCR4可能通过抑制BTK磷酸化来调节BV2细胞中NF-κB的活化、焦亡和氧化应激。

图8 抑制CXCR4降低hemin处理BV2中NLRP3介导的焦亡和脂质过氧化

 

09

验证BTK与CXCR4之间的关系

        为了进一步验证BTK与CXCR4之间的关系，我们在SAH小鼠体内注射慢病毒以过表达CXCR4，结果如图9示，与未处理的SAH小鼠及注射空载慢病毒的SAH小鼠相比，过表达CXCR4可进一步下调ZO-1和occludin的表达，上调p-BTK、NLRP3、p-P65、GSDMD-N、IL-1β、IL-18和NOX2的表达，而Ibrutinib处理可显著改善血脑屏障破坏，降低p-BTK、p-P65、NLRP3、GSDMD-N、NOX2和炎症因子IL-1β和IL-18的表达。

图9 抑制BTK磷酸化可以逆转CXCR4加重的SAH小鼠血脑屏障损伤和炎症

 

10

SAH患者脑脊液中CXCR4、GSDMD和IL-1β的水平

       为了在临床水平验证SAH患者脑脊液中CXCR4、GSDMD和IL-1β的水平，我们对SAH患者(n=30)和对照组(n=10)的脑脊液进行了ELISA检测。结果如图10所示，与对照组相比，SAH患者CXCR4、GSDMD和IL-1β的水平显著升高。采用Pearson相关系数分析出院后6个月CXCR4水平与GSDMD、IL-1β水平及mRS评分的关系，结果发现，CXCR4与GSDMD (r = 0.2067, P = 0.0116)、IL-1β (r = 0.3094, P < 0.001)、mRS评分(r = 0.3135, P < 0.01)呈正相关。此外，mRS评分越高，人脑脊液中CXCR4的水平越高。受试者工作特征(ROC)曲线分析显示，6个月随访时，SAH后CXCR4水平(AUC= 0.85，敏感性=90%，特异性=65%，P=0.0028)(图10H)对预后具有中等诊断价值。根据ROC曲线，CXCR4的截止值为1903pg/mL。

图10 CXCR4与人脑脊液GSDMD、IL-1β水平及预后的高度相关

 

研究结论

。

该团队通过研究CXCR4和P-BTK在体内外对NLRP3介导的焦亡的影响，以及CXCR4在SAH患者CSF中的潜在诊断作用，发现抑制CXCR4-BTK轴可通过调节NLRP3介导的EBI焦亡和NF-κB活化，显著减轻SAH后EBI的神经炎症和脂质过氧化。因此，CXCR4-BTK可能为SAH患者的神经炎症和脂质过氧化提供有希望的治疗策略。