在ELISA实验中，孵育环节具有至关重要的意义。孵育，也称为温育，是确保抗原抗体反应得以充分进行的关键步骤。这一过程中，抗原与抗体在特定的温度和时间条件下相互作用，从而完成免疫反应的识别与结合。

 

 

确保孵育的时间充足

 

 

 

 

 

 

孵育是抗原与抗体特异性结合的过程，这一过程需要一定的时间来完成。抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在特定的温度条件下反应足够的时间。如果孵育时间不足，可能会导致抗原与抗体的结合不充分，影响实验结果的准确性和可靠性。

 

孵育时间的充足与否还直接关系到测定下限。在ELISA测定中，如果孵育时间不够，可能会影响测定结果的灵敏度和下限，特别是弱阳性样本可能无法被准确检测出来。

 

此外，还需要考虑到温度对孵育时间的影响。孵育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。但在实际操作中，尤其是在室温较低或非水浴状态下，微孔板从室温升至设定温度（如37℃）需要一定的时间。如果在升温过程中就开始计时，很可能导致实际的孵育时间不足。

 

因此，为了保证ELISA实验的准确性和可靠性，必须确保孵育时间的充足。在实验中，应根据所使用的试剂盒和实验条件，合理设置孵育时间，并在温度达到设定值后再开始计时，以确保抗原与抗体的充分结合。

 

 

选择合适的孵育温度

 

 

 

 

 

 

在ELISA实验中，孵育温度直接关系到抗原抗体结合的效率和特异性，常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等，贝茵莱试剂盒两次孵育过程均采用的37℃。

 

孵育温度能够影响抗原抗体反应的动力学。在一定的温度范围内，较高的温度可以加速抗原抗体的结合反应，缩短反应所需的时间。然而，温度并不是越高越好，过高的温度可能导致非特异性结合增加，背景干扰增强，反而降低实验的准确性。因此，选择合适的孵育温度对于平衡反应速度和特异性至关重要。

 

其次，孵育温度还能够影响抗原抗体的稳定性。抗原和抗体作为生物大分子，其结构和功能在一定程度上受到温度的影响。过高的温度可能导致抗原抗体变性或失活，从而影响实验的准确性。而适当的孵育温度可以保持抗原抗体的稳定性，确保反应的顺利进行。

 

此外，不同的抗原抗体体系可能对温度有不同的要求。有些抗原抗体体系在较低的温度下结合更为稳定，而有些则需要在较高的温度下才能达到理想的结合效果。因此，在选择孵育温度时，需要考虑到具体的抗原抗体特性以及实验条件。

 

 

孵育Tips

 

 

跟着做不会错

 

 

01

 

 

 

操作中务必严格按照说明书控制孵育时间及温度。同时为避免边缘效应，应特别注意封闭措施。

02

 

 

 

为确保各板温度迅速平衡，切勿将反应板叠加放置。

03

 

 

 

在孵育方式上，干育和水浴的影响差异明显，通常推荐使用水浴，但需注意将固相板完全浸入水中，以确保受热均匀。此外，试剂盒通常设定的反应温度为37℃，此温度下放置30分钟可能导致水分大量蒸发，进而影响反应体系中各物质的浓度，最终可能导致OD值增加。因此，温育时应贴封片或加盖，防止标本或稀释液蒸发。

04

 

 

 

试剂盒设定的反应时间和温度并非固定不变，提高反应温度或延长反应时间均可能加速反应进程，导致反应程度超过试剂盒设定的标准，进而产生阴性高值或假阳性结果。